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Wie stark sollte der Puffer sein?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule

Der Fall Puffer sind bei der Trennung von ionischen Substanzen wichtig: Oft ist erst durch einen bestimmten, konstant zu haltenden pH-Wert (deswegen der Puffer) die gewünschte Selektivität und Reproduzierbarkeit zu erreichen. So weit, so gut. Mal übernimmt man nun eine Methode, in der der Eluent 5 mMol stark ist, bei der nächsten Methode ist die Rede von 100- oder sogar 150-mMol-Lösungen, und manchmal weiß man es einfach nicht, wie bei folgendem Beispiel: ,,Man wiege so viel mg von Salz X und gebe so viel ml an Säure Y oder Base Z zu!“ Wie kritisch ist die Pufferstärke jetzt wirklich und…

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21. August 1995

Der pH-Wert meines Eluenten ist zu hoch/zu niedrig, was ist zu tun?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule

Der Fall Nehmen wir an, Sie haben festgestellt, dass für Ihre Probe die beste Trennung mit einer C18-Säule bei pH = 9,5 zu erzielen ist. Das ist zwar prima, doch Ihre Säule ist von diesem hohen pH-Wert wahrscheinlich nicht sonderlich begeistert (ab pH ≈ 8 löst sich Kieselgel auf). Die Säulenqualität würde schnell nachlassen. Natürlich könnte man nach einer geeigneteren Säule suchen, z. B. einer Hybridsäule oder einer auf Polymer- bzw. Aluminiumoxidbasis usw. Doch die Umstellung kostet Zeit und Geld, oder schlicht und ergreifend: Sie dürfen keine andere Säule verwenden! Eine Vorsäule könnte die Lösung sein. Manchmal wird jedoch nach…

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21. Juli 1995

Methanol oder Acetonitril?

By ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Eluent, HPLC-Tipps

Der Fall ACN/H2O- und MeOH/H2O-Gemische sind die häufigsten Eluenten in der RP-HPLC. Kann es eine Präferenz geben? Was ist nun besser: ACN oder MeOH? Die Lösung Natürlich gibt es keine allgemeingültige Antwort, spezielle Selektivitätsunterschiede können sehr wichtig sein. Beispielsweise können einerseits bei bestimmten Substanzklassen Methanolate entstehen und ACN stabilisiert andererseits oktaedrische Cu2+-, Cd2+- und Zn2+-Komplexe. Nachfolgend werden einige generelle Unterschiede der zwei Lösungsmittel gegenübergestellt. Tab. 1: Vergleich zwischen Acetonitril und Methanol Das Fazit Offensichtlich sind die Vorteile von ACN den meisten Anwendern wichtiger als seine Nachteile, es wird in ca. 70 % der RP-Trennungen eingesetzt. Siehe auch Tipp „Methanol vs….

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21. Juni 1995

Wie entgase ich meinen Eluenten am besten?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Unruhige Basislinie, starkes Rauschen und Druckschwankungen sind u. a. Hinweise dafür, dass Sie Ihren Eluenten überhaupt bzw. noch besser entgasen sollten. Wann ist dieser Schritt notwendig? Die Lösung Nachfolgend ist die Effektivität der vier wichtigsten Entgasungsmethoden für ein polares (Abb. 1. links, MeOH) und ein unpolares (Abb. 1 rechts, Hexan) Lösungsmittel dargestellt. Abb. 1: Effektivität von Entgasungsmethoden für ein polares (MeOH) und ein unpolares (Hexan) Lösungsmittel. (Quelle; J. W. Dolan, L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Human Press, 1989 Dazu folgende Bemerkungen: Auskochen ist nicht praktikabel Entgasung mittels Vakuum ist eine gute Methode. Sie erfolgt oft in einem…

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21. Mai 1995

Wie entferne ich organische Verunreinigungen schnell von einer RP-Phase?

By ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Stark organische Substanzen (Lipide, große Moleküle etc.) können an RP-Phasen, insbesondere C18, regelrecht ,,kleben“ bleiben. Das Ergebnis ist manchmal ein hoher Rückdruck und fast immer eine Verschlechterung der Trennung. Es kann zu der Bildung von breiten und tailenden Peaks oder auch Geisterpeaks kommen. Man müsste also mit MeOH oder ACN spülen. Das bedarf aber eines gewissen Aufwands und die Zeit ist oft knapp. Was tun? Die Lösung Injizieren Sie 100 μl oder 200 μl MeOH oder ACN. (Überprüfen Sie vorher, ob durch die ACN-Injektion in pufferhaltigen Eluenten kein Niederschlag entsteht!). Sollten sich organische Substanzen an der RP-Oberfläche befinden,…

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21. April 1995

Warum kann ich polare Substanzen an der einen C18-Säule ver­nünftig trennen und an der anderen kaum?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Stationäre Phase, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie möchten polare Substanzen mittels RP-Chromatographie trennen. Nehmen wir an, es handelt sich dabei um Säuren, und Sie möchten mehrere Säulen auf ihre Eignung testen. Natürlich machen Sie es richtig und wählen „gute“ Kandidaten, d. h. nachsilanisierte Phasen.* Trotz Ihrer überlegten Wahl erhalten Sie bei gleichen chro­matographischen Bedingungen (Eluent, pH-Wert, Temperatur etc.) mit einer Säule vernünftige Chromatogramme, während eine zweite, ebenfalls nachsilanisierte („endcappede“) Säule tailende Peaks liefert. Warum? *Anmerkung: Nachsilanisierte C18-Phasen sind geeignet zur Trennung von polaren Substanzen – jedenfalls was die Peakform betrifft … Das Kiesel­gel wurde nach der Umsetzung mit dem C18-Alkylsilan, zur Herstellung der RP-Phase,…

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19. März 1995

Ist diese C18-Säule für meine Probe prinzipiell geeignet?

By B Optimierung, HPLC-Tipps, Nicht berücksichtigen, Säule, Säulenauswahl

Der Fall Bei der Vielzahl an C18-Säulen heute auf dem Markt wäre es unökonomisch, die eine oder andere C18-Säule bei einer neuen Fragestellung auf „gut Glück“ auszutesten. Wenn tatsächlich keinerlei Informationen vorliegen, sollte man versuchen, die Auswahl einzuengen. Dazu gibt es einige Regeln. Die Lösung Folgende Substanzeigenschaften der Probe sind für die ersten Entscheidungen hilfreich: Löslichkeitsverhalten Chemische Natur Molekulargewicht Zunächst sollte entschieden werden, ob für Ihre Probe eine C18-Säule auf Kiesgelba­sis in einem klassischen RP-System grundsätzlich in Frage kommt. Anschließend können bestimmte Säulen anhand der Substanzeigenschaften aussortiert werden, und andere wiederum sollten als Kandidaten im Auge behalten werden. Tab. 2.1:…

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19. Februar 1995

Was kann ich dem Namen eines Säulenfüllmaterials entnehmen?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Säule, Stationäre Phase

Der Fall Schauen wir uns die Sache erst einmal bei den Autos an, betrachten wir einige „historische“ Modelle: Beim ,,Cinquecento“ wissen wir, es handelt sich um den kleinen Italiener mit 500 ccm, bei der wilden ,,Ente“, 2 CV, ist die Rede von zwei ,,Pferden“ im Motor, bei ,,quadro“ haben wir es logischerweise mit einem Allradantrieb zu tun. KA, MOKKA und SMART sind dagegen pfiffige Namenskreationen, die nichts über Eigenschaften und Spezifikationen verraten. Ähnlich ist es auch bei den HPLC-Materialien. Was lassen uns die Hersteller wissen? Die Lösung Es gibt Materialbezeichnungen ohne jegliche Informationen, z. B. INTERCHROM, ASAHIPAK, und andere, die…

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18. Januar 1995

Trennung von ionischen Substanzen – wann ist was besser: Endcappede Phasen, inerte Phasen, Phosphatpuffer oder Ionenpaarreagenz? Teil I

By B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Säulenauswahl

Der Fall Einige, mehrere oder alle Peaks in Ihrem Chromatogramm eluieren mit einem Tailing. Die Gründe können vielfältig sein: Säulenüberladung, keine optimale Parametereinstellung am Detektor (z. B. Zeitkonstante, Datenrateaufnahme), größeres Totvolumen im System. Oder hängt es letzten Endes doch mit der Säule zusammen? Nehmen wir an, Sie können die ersten drei Fälle als Ursachen ausschließen und das Totvolumen Ihrer Anlage ist auch in Ordnung. Dann betrifft es doch die Säule. Die Frage ist nur: Was genau an der Säule? Wie kann man das überprüfen und was sind schließlich die notwendigen Maßnahmen? Die Lösung Wenn die oben beschriebenen Fälle als Ursachen…

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19. Dezember 1994

Welcher Fluss ist optimal für mich?

By Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, Fluss, HPLC-Tipps, Optimierung

Der Fall Vorbemerkung: Nachfolgende Ausführungen beziehen sich aus praktischer Sicht im Wesentlichen auf isokratische Trennungen. Die Theorie der HPLC gilt sehr wohl auch für Gradiententrennungen, jedoch spielt der Fluss dort eine gänzlich andere Rolle, siehe dazu diesen HPLC-Tipp. Die Fließgeschwindigkeit beeinflusst die Trennung in der HPLC, denn von ihr hängt die Retentionszeit und die Trennleistung (Bodenzahl, Effizienz) einer Säule ab. Durch eine Abnahme des Flusses eluieren die Peaks später und der Abstand dazwischen vergrößert sich. Eine Flusserhöhung bewirkt genau das Gegenteil. Der Zusammenhang zwischen Fluss und Säuleneffizienz wird durch die Van-Deemter-Kurve wiedergegeben siehe Abb. 1. Abb.1: Die Abhängigkeit der theoretischen…

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18. November 1994