0
Kategorie

B Optimierung

Schnelle Methodenentwicklung in der RP-HPLC

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Sie müssen eine Methode schnell entwickeln und Sie haben wenig Zeit. Selbstverständlich verfügen Sie über eine moderne Gradientenanlage und über ein ansehnliches Säulen-Portfolio. Was wäre nun eine sinnvolle, ökonomische Vorgehensweise, um die Methode wenigstens grob entwickeln zu können? Die Lösung Hardware-Voraussetzung: Sollten Sie über eine Niederdruck-Gradientenanlage mit PDA verfügen, benötigen Sie lediglich ein 6-Säulenschaltventil, imfalle eines Hochdruck-Gradienten zusätzlich ein Eluentenschaltventil. Das Konzept Bekanntlich hängt die Selektivität von der stationären Phase, von dem Eluenten (inkl. Gradient) und von der Temperatur ab, wobei zunächst die zwei Erstgenannten in Frage kommen. Stationäre Phase bedeutet „Chemie“ der Oberfläche (also, polarer/hydrophober Charakter der…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
7. Mai 2007

Sind hydrophobe oder polare Wechselwirkungen für meine Trennung notwendig?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Bekanntlich können in der HPLC, je nach Analyt und chromatographische Bedingungen, hydrophobe Wechselwirkungen dominieren oder aber es liegt ein Mischmechanismus vor. Letzteres bedeutet in aller Regel, es sind zusätzliche polare oder gar ionische Wechselwirkungen wirksam. Sterische Aspekte, die auch für kleine Moleküle eine Rolle spielen können, lassen wir hier außer acht. Nun stellt sich die Frage erstens, wann herrschen vorwiegend eher hydrophobe oder eher polare Wechselwirkungen und zweitens, welche sollte ich wann, wie begünstigen? Die Lösung Hier angesprochenes Thema ist ein sehr Komplexes und es bedarf eines nicht unbeträchtlichen Umfangs, wollte man jenes genauer behandeln. Dennoch sind aus…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
7. Januar 2007

Legale Tricks, um eine geforderte Bodenzahl doch noch zu erreichen

Von B Optimierung, Bodenzahl, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Totvolumen

Der Fall Nehmen wir an, dass eine der Forderungen in der Prüfvorschrift einer Routine-Methode lautet: „Bodenzahl für Peak X mindestens 5.000“. Dass ich der Meinung bin, dass eine derartige Forderung unnötig ist, bringt nichts zur Sache, lassen Sie mich dennoch diese These kurz erläutern: Bei einer Trenntechnik wie der HPLC geht es ja um Trennung und das wichtigste – um nicht zu sagen das ausschließliche – Kriterium für eine ausrechende Trennung ist die Auflösung (Auflösung, vereinfacht: Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis). Wenn ich nun die geforderte Auflösung von beispielsweise 1,3 oder 1,5 erreiche, bedeutet dies, dass ich in…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
7. Januar 2006

Apparative Notwendigkeiten für schnelle, schmale Peaks

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Miniaturisierung in der HPLC ist seit langem ein zeitloses Thema…  Die Diskussion ist zwar seit Mitte der 1970er Jahre im Gange, doch werden erst in der jüngeren Vergangenheit neben den entsprechenden Geräten auch eine Reihe von Säulen mit den Dimensionen 10-20 mm Länge, 1,0-2,1 mm Innendurchmesser und Sub 2 µm Teilchen in bemerkenswerter Vielfalt angeboten. Bei solchen Säulen haben wir natürlich mit sehr kurzen Analysezeiten und schmalen Peaks zu tun. Bemerkung: Kapillarsäulen, „Pillar Array Columns“, „Column On a Chip“ sind in der Routine (noch) eher selten, daher werde ich hier nicht darauf eingehen. Was sind nun die (apparativen)…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
7. Mai 2005

Trennung von sauren Komponenten mittels RP-HPLC

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Die Trennung von basischen ist ein viel, viel schwierigeres Unterfangen als die Trennung von sauren Komponenten. Letzteres Trennproblem ist – stark vereinfacht formuliert – fast ein Kinderspiel. Wie geht nun das „Spiel“? Die Lösung Wir unterhalten uns zunächst über den Eluenten: Der wichtigste Parameter ist mit Abstand der pH-Wert, je nach Stärke der zu trennenden Säuren sollte er sich zwischen ca. 1,5 und 4,0 bewegen. Mit seiner Hilfe können die sauren Komponenten neutralisiert werden, oder allgemein formuliert, deren Ionisierungszustand und damit die Wechselwirkung mit der stationären Phase beeinflusst werden. Der Einsatz von Puffern ist grundsätzlich richtig und sinnvoll,…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
7. April 2004

Säulendimensionen und Gradiententrennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Wir haben uns bereits in diesem HPLC-Tipp über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der „Front“ veranlassen mich jedoch ein zweites Mal das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 x 4 mm, Fluss, 1 ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13-14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min x 20 min = 20 ml und 1,5…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
14. Oktober 2003

Säulenlänge, Fluss und Retentionszeiten bei Gradienten-Trennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Hintergrund Wichtig in der HPLC sind „vernünftige“ Wechselwirkungen. So heißt es beispielsweise für isokratische Trennungen: Die interessierenden Komponenten sollten mit einem Retentionsfaktor k, von ca. 2-8 eluieren. Hier haben wir einen sinnvollen Kompromiss zwischen ausreichend starken Wechselwirkungen, robusten Bedingungen und akzeptabler Retentionszeit. Bei Gradienten-Trennungen gilt analog der mittlere Retentionsfaktor : k = mittlerer k-Wert; Analyt befindet sich in der Mitte der Säule (Längsrichtung) tG = Gradientendauer [min] F = Fluss [ml/min] Vm = Säulenvolumen Δ%B = Änderung von B während der Gradientelution S = Steigung der -Kurve; für kleine Moleküle kann für ein Wert von ca. 5 angenommen…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
14. Juni 2003

Trennung von isomeren Verbindungen

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung

Der Fall Die Trennung von isomeren Verbindungen kann sich als ein recht schwieriges Trennproblem erweisen. Das liegt u.a. daran, dass die Eigenschaften von Isomeren häufig sich stark ähneln. Welche Säulen bzw. Eluenten kämen nun in Frage? Die Lösung Vorbemerkung: Schwierige Fälle bedürfen oft unorthodoxen Lösungswegen. Diese allgemeine Maxime gilt auch hier – vor allem, wenn es um einen einmaligen, wichtigen Fall geht (Reklamation, Toxizitätsproblematik) und nicht um die Entwicklung einer Routinemethode, bei der Robustheit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im Vordergrund stehen. Also, wundern Sie sich bitte nicht ob einiger meiner Vorschläge! Säulenauswahl Hydrophobe Phasen sind hier kaum geeignet, denken Sie…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
5. Mai 2003

Schnelle Überprüfung der Peakhomogenität, Teil 2

Von B Optimierung, HPLC-Tipps

Der Fall Die Peaks machen am Ende einer Trennungsoptimierung einen „ordentlichen“, symmetrischen Eindruck, auch die Auflösung zwischen den Peaks ist zufriedenstellend. Wie können Sie nun mit einem vertretbaren Aufwand überprüfen, ob alle vorhandenen Komponenten tatsächlich sichtbar sind? Die Lösung Es gibt zweifelsohne eine Reihe möglicher Wege: Von einer Änderung der chromatographischen Parameter (z.B. pH-Wert, Temperatur, stationäre Phase) bis hin zu Kopplungstechniken wie LC-MS. Je nach Umfeld, Wichtigkeit der Probe etc. mag die eine oder andere Massnahme richtig bzw. gerechtfertigt sein. Nachfolgend ein Vorschlag, der sich relativ leicht realisieren lässt: Sie wiederholen die Trennung bei einer möglichst unterschiedlichen Kombination Säule –…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
9. Februar 2003

Selektivität „nur“ durch unterschiedliche Wechselwirkungen?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, polare Komponenten, Säulenauswahl

Der Fall Wir haben alle gelernt, dass – außer vielleicht bei der Ausschluss- und der Affinitätschromatographie – eine chromatographische Trennung durch unterschiedliche Wechselwirkungen der zu trennenden Analyte mit der stationären Phase zustande kommt. Dabei werden je nach Mechanismus stark ionische bis stark hydrophobe Wechselwirkungen angenommen. Verteilungsmechanismen sind bei der HILIC ein Thema, sonst finden sie wenig Erwähnung. Sind aber lediglich Wechselwirkungen alles was die Selektivität beeinflusst? Die Lösung Nein. Auch für kleine Moleküle können sterische Aspekte von Bedeutung sein, siehe dazu Abb. 1. Bei der Trennung einer Mischung von Metaboliten von tricyclischen Antidepressiva, also durchaus kleine Moleküle, werden an zwei „polaren“…

Um diesen Beitrag einsehen zu können, musst du eine der HPLC-Tipps Datenbanken Lizenzen erwerben.

Weiterlesen
4. Januar 2003