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B Optimierung

Einfluss des Probelösungsmittels auf die Trennung

Von A Fehlersuche, B Optimierung, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Wir haben uns bereits über den Einfluss der Probelösung auf die Peakform und somit auf die Trennung unterhalten. So führt ein zu starkes Probelösungsmittel (Probe z. B. in mehr MeOH oder ACN im Vergleich zum Eluenten) zum Fronting oder gar zu Doppelpeaks, andererseits führt ein schwaches Probelösungsmittel – mehr Wasser im Vergleich zum Eluenten – zur Aufkonzentrierung am Säulenkopf und somit zu einer Verbesserung der Peakform. Die Folge lautet im zweiten Fall: Verbesserung der Auflösung bzw. Erniedrigung der Nachweisgrenze, vor allem bei früh eluierenden Peaks. In letzter Zeit haben wir uns intensiv mit der Injektion befasst und haben…

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Empfehlungen in Geräte-Handbüchern – seien Sie etwas vorsichtig!

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Handbücher von Gerätehersteller sind meist sehr nützlich – zwar manchmal viel zu umfangreich und von Softwarespezialisten statt von Analytikern verfasst, aber dennoch: Manches wird erst nach deren Lektüre wirklich klar. Trotzdem ist Vorsicht geboten: Einige Empfehlungen sind irreführend oder einfach falsch. Welche Beispiele könnte man diesbezüglich anführen ? Die Lösung Dergleichen gibt es einiges, hier möchte ich beispielhaft auf zwei Empfehlungen bzgl. Einstellparameter eingehen: 1. In manch einem Manual steht, dass ein Peak mit 20-25 Datenpunkten ausreichend darstellbar sei. Dies stimmt jedoch nicht für schnelle Peaks. Bei einer Peakbreite von z. B. 9 s im Falle eines schnell…

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Eine/mehrere polare Komponente(n) eluiert(en) direkt an der Totzeit – was tun?

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule

Der Fall Nehmen wir an, Sie können Ihre viele, mehr oder weniger apolare Komponenten recht gut trennen. Nur eine oder zwei Komponente(n) bereitet(n) Ihnen Kopfzerbrechen: Jene polare eluiert(en) direkt beim Totzeitpeak bzw. an der Flanke des an der Totzeit eluierenden polaren „Drecks“. Wie auch immer, gestaltet sich deren Integration als wahres Abenteuer. Wenn Sie nun großartig Gradient, Säule usw. ändern würden, mit dem Ziel diese(n) polare(n) Peak(s) nach hinten zu verschieben, könnte es sein, dass womöglich die Trennung restlicher Peaks sich ändert/verschlechtert und dazu haben Sie logischerweise keine Lust. Was tun? Die Lösung Bauen Sie vor Ihre C18-Säule eine kurze…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von B Optimierung, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Nachweisgrenze, Optimierung, Uncategorized

Alternativen zu Phosphor- und Trifluoressigsäure Bekanntlich werden für den stark sauren Bereich (pH-Wert um 2-2,5) gerne H3PO4 oder TFA verwendet. Der pH-Wert wird häufig nicht eingestellt, auch auf die Verwendung von Puffern wird verzichtet: Eine mögliche kleine Verschiebung des pH-Wertes ist in diesem recht sauren Bereich nicht tragisch, eine merkliche Verschiebung der Retentionszeit wird selten beobachtet. Nun zeigt sich immer wieder, dass nicht nur der pH-Wert – sicherlich der wichtigste Faktor! – sondern auch die verwendete Säure die Selektivität beeinflussen kann. Man sollte bei Optimierungsversuchen im Sauren beispielsweise neben den üblich verwendeten Säuren Phosphor-, Trifluoressig-, Essig-, und Ameisensäure auch an…

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Schnelle Methodenentwicklung in der RP-HPLC

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Sie müssen eine Methode schnell entwickeln und Sie haben wenig Zeit. Selbstverständlich verfügen Sie über eine moderne Gradientenanlage und über ein ansehnliches Säulen-Portfolio. Was wäre nun eine sinnvolle, ökonomische Vorgehensweise, um die Methode wenigstens grob entwickeln zu können? Die Lösung Hardware-Voraussetzung: Sollten Sie über eine Niederdruck-Gradientenanlage mit PDA verfügen, benötigen Sie lediglich ein 6-Säulenschaltventil, imfalle eines Hochdruck-Gradienten zusätzlich ein Eluentenschaltventil. Das Konzept Bekanntlich hängt die Selektivität von der stationären Phase, von dem Eluenten (inkl. Gradient) und von der Temperatur ab, wobei zunächst die zwei Erstgenannten in Frage kommen. Stationäre Phase bedeutet „Chemie“ der Oberfläche (also, polarer/hydrophober Charakter der…

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Sind hydrophobe oder polare Wechselwirkungen für meine Trennung notwendig?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Bekanntlich können in der HPLC, je nach Analyt und chromatographische Bedingungen, hydrophobe Wechselwirkungen dominieren oder aber es liegt ein Mischmechanismus vor. Letzteres bedeutet in aller Regel, es sind zusätzliche polare oder gar ionische Wechselwirkungen wirksam. Sterische Aspekte, die auch für kleine Moleküle eine Rolle spielen können, lassen wir hier außer acht. Nun stellt sich die Frage erstens, wann herrschen vorwiegend eher hydrophobe oder eher polare Wechselwirkungen und zweitens, welche sollte ich wann, wie begünstigen? Die Lösung Hier angesprochenes Thema ist ein sehr Komplexes und es bedarf eines nicht unbeträchtlichen Umfangs, wollte man jenes genauer behandeln. Dennoch sind aus…

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Legale Tricks, um eine geforderte Bodenzahl doch noch zu erreichen

Von B Optimierung, Bodenzahl, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Totvolumen

Der Fall Nehmen wir an, dass eine der Forderungen in der Prüfvorschrift einer Routine-Methode lautet: „Bodenzahl für Peak X mindestens 5.000“. Dass ich der Meinung bin, dass eine derartige Forderung unnötig ist, bringt nichts zur Sache, lassen Sie mich dennoch diese These kurz erläutern: Bei einer Trenntechnik wie der HPLC geht es ja um Trennung und das wichtigste – um nicht zu sagen das ausschließliche – Kriterium für eine ausrechende Trennung ist die Auflösung (Auflösung, vereinfacht: Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis). Wenn ich nun die geforderte Auflösung von beispielsweise 1,3 oder 1,5 erreiche, bedeutet dies, dass ich in…

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Apparative Notwendigkeiten für schnelle, schmale Peaks

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Miniaturisierung in der HPLC ist seit langem ein zeitloses Thema…  Die Diskussion ist zwar seit Mitte der 1970er Jahre im Gange, doch werden erst in der jüngeren Vergangenheit neben den entsprechenden Geräten auch eine Reihe von Säulen mit den Dimensionen 10-20 mm Länge, 1,0-2,1 mm Innendurchmesser und Sub 2 µm Teilchen in bemerkenswerter Vielfalt angeboten. Bei solchen Säulen haben wir natürlich mit sehr kurzen Analysezeiten und schmalen Peaks zu tun. Bemerkung: Kapillarsäulen, „Pillar Array Columns“, „Column On a Chip“ sind in der Routine (noch) eher selten, daher werde ich hier nicht darauf eingehen. Was sind nun die (apparativen)…

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Trennung von sauren Komponenten mittels RP-HPLC

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Die Trennung von basischen ist ein viel, viel schwierigeres Unterfangen als die Trennung von sauren Komponenten. Letzteres Trennproblem ist – stark vereinfacht formuliert – fast ein Kinderspiel. Wie geht nun das „Spiel“? Die Lösung Wir unterhalten uns zunächst über den Eluenten: Der wichtigste Parameter ist mit Abstand der pH-Wert, je nach Stärke der zu trennenden Säuren sollte er sich zwischen ca. 1,5 und 4,0 bewegen. Mit seiner Hilfe können die sauren Komponenten neutralisiert werden, oder allgemein formuliert, deren Ionisierungszustand und damit die Wechselwirkung mit der stationären Phase beeinflusst werden. Der Einsatz von Puffern ist grundsätzlich richtig und sinnvoll,…

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Säulendimensionen und Gradiententrennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Wir haben uns bereits in diesem HPLC-Tipp über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der „Front“ veranlassen mich jedoch ein zweites Mal das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 x 4 mm, Fluss, 1 ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13-14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min x 20 min = 20 ml und 1,5…

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