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B Optimierung

Apparative Notwendigkeiten für schnelle, schmale Peaks

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Miniaturisierung in der HPLC ist seit langem ein zeitloses Thema…  Die Diskussion ist zwar seit Mitte der 1970er Jahre im Gange, doch werden erst in der jüngeren Vergangenheit neben den entsprechenden Geräten auch eine Reihe von Säulen mit den Dimensionen 10-20 mm Länge, 1,0-2,1 mm Innendurchmesser und Sub 2 µm Teilchen in bemerkenswerter Vielfalt angeboten. Bei solchen Säulen haben wir natürlich mit sehr kurzen Analysezeiten und schmalen Peaks zu tun. Bemerkung: Kapillarsäulen, „Pillar Array Columns“, „Column On a Chip“ sind in der Routine (noch) eher selten, daher werde ich hier nicht darauf eingehen. Was sind nun die (apparativen)…

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7. Mai 2005

Trennung von sauren Komponenten mittels RP-HPLC

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Die Trennung von basischen ist ein viel, viel schwierigeres Unterfangen als die Trennung von sauren Komponenten. Letzteres Trennproblem ist – stark vereinfacht formuliert – fast ein Kinderspiel. Wie geht nun das „Spiel“? Die Lösung Wir unterhalten uns zunächst über den Eluenten: Der wichtigste Parameter ist mit Abstand der pH-Wert, je nach Stärke der zu trennenden Säuren sollte er sich zwischen ca. 1,5 und 4,0 bewegen. Mit seiner Hilfe können die sauren Komponenten neutralisiert werden, oder allgemein formuliert, deren Ionisierungszustand und damit die Wechselwirkung mit der stationären Phase beeinflusst werden. Der Einsatz von Puffern ist grundsätzlich richtig und sinnvoll,…

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7. April 2004

Säulendimensionen und Gradiententrennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Wir haben uns bereits in diesem HPLC-Tipp über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der „Front“ veranlassen mich jedoch ein zweites Mal das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 x 4 mm, Fluss, 1 ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13-14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min x 20 min = 20 ml und 1,5…

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14. Oktober 2003

Säulenlänge, Fluss und Retentionszeiten bei Gradienten-Trennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Hintergrund Wichtig in der HPLC sind „vernünftige“ Wechselwirkungen. So heißt es beispielsweise für isokratische Trennungen: Die interessierenden Komponenten sollten mit einem Retentionsfaktor k, von ca. 2-8 eluieren. Hier haben wir einen sinnvollen Kompromiss zwischen ausreichend starken Wechselwirkungen, robusten Bedingungen und akzeptabler Retentionszeit. Bei Gradienten-Trennungen gilt analog der mittlere Retentionsfaktor : k = mittlerer k-Wert; Analyt befindet sich in der Mitte der Säule (Längsrichtung) tG = Gradientendauer [min] F = Fluss [ml/min] Vm = Säulenvolumen Δ%B = Änderung von B während der Gradientelution S = Steigung der -Kurve; für kleine Moleküle kann für ein Wert von ca. 5 angenommen…

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14. Juni 2003

Trennung von isomeren Verbindungen

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Optimierung

Der Fall Die Trennung von isomeren Verbindungen kann sich als ein recht schwieriges Trennproblem erweisen. Das liegt u.a. daran, dass die Eigenschaften von Isomeren häufig sich stark ähneln. Welche Säulen bzw. Eluenten kämen nun in Frage? Die Lösung Vorbemerkung: Schwierige Fälle bedürfen oft unorthodoxen Lösungswegen. Diese allgemeine Maxime gilt auch hier – vor allem, wenn es um einen einmaligen, wichtigen Fall geht (Reklamation, Toxizitätsproblematik) und nicht um die Entwicklung einer Routinemethode, bei der Robustheit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im Vordergrund stehen. Also, wundern Sie sich bitte nicht ob einiger meiner Vorschläge! Säulenauswahl Hydrophobe Phasen sind hier kaum geeignet, denken Sie…

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5. Mai 2003

Schnelle Überprüfung der Peakhomogenität, Teil 2

Von B Optimierung, HPLC-Tipps

Der Fall Die Peaks machen am Ende einer Trennungsoptimierung einen „ordentlichen“, symmetrischen Eindruck, auch die Auflösung zwischen den Peaks ist zufriedenstellend. Wie können Sie nun mit einem vertretbaren Aufwand überprüfen, ob alle vorhandenen Komponenten tatsächlich sichtbar sind? Die Lösung Es gibt zweifelsohne eine Reihe möglicher Wege: Von einer Änderung der chromatographischen Parameter (z.B. pH-Wert, Temperatur, stationäre Phase) bis hin zu Kopplungstechniken wie LC-MS. Je nach Umfeld, Wichtigkeit der Probe etc. mag die eine oder andere Massnahme richtig bzw. gerechtfertigt sein. Nachfolgend ein Vorschlag, der sich relativ leicht realisieren lässt: Sie wiederholen die Trennung bei einer möglichst unterschiedlichen Kombination Säule –…

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9. Februar 2003

Selektivität „nur“ durch unterschiedliche Wechselwirkungen?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, polare Komponenten, Säulenauswahl

Der Fall Wir haben alle gelernt, dass – außer vielleicht bei der Ausschluss- und der Affinitätschromatographie – eine chromatographische Trennung durch unterschiedliche Wechselwirkungen der zu trennenden Analyte mit der stationären Phase zustande kommt. Dabei werden je nach Mechanismus stark ionische bis stark hydrophobe Wechselwirkungen angenommen. Verteilungsmechanismen sind bei der HILIC ein Thema, sonst finden sie wenig Erwähnung. Sind aber lediglich Wechselwirkungen alles was die Selektivität beeinflusst? Die Lösung Nein. Auch für kleine Moleküle können sterische Aspekte von Bedeutung sein, siehe dazu Abb. 1. Bei der Trennung einer Mischung von Metaboliten von tricyclischen Antidepressiva, also durchaus kleine Moleküle, werden an zwei „polaren“…

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4. Januar 2003

Die Sicht der Dinge… Oder: Selektivität vs. Peaksymmetrie von basischen Komponenten an hydrophoben Phasen

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Säulenauswahl

Nach Durchsicht meiner Notizen habe ich mich für folgendes Beispiel entschieden: Der Fall Habt ihr vor, stark basische Substanzen zu trennen? So, so, dann aber Vorsicht: Nehmt dazu von mir aus eure geliebten, modernen, teueren, sauberen, Metallionen-armen, gut abgedeckten, super endcappten Phasen. In einer Hinsicht habt ihr Recht: Ihr bekommt sicherlich schöne, symmetrische, schlanke Peaks –eine „scharfe“ Trennung eben, siehe Abb. 1. Abb.1 „Trennung“ von Pyridin/Benzylamin, Uracil (inert!), Phenol in einem sauren Phosphatpuffer an einer hydrophoben RP-Phase Seht ihr aber auch alles? Merke: Mit polaren/ionischen Komponenten und hydrophoben Phasen ist Umsicht eine unabdingbare Tugend. Die Lösung Tut mir und euch…

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5. Dezember 2002

Schnelle Optimierung einer bestehenden Gradientenmethode

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ich war einmal in einem befreundeten Unternehmen, in dem routinemäßig viele Gradientenmethoden laufen. Nicht alle waren aus Anwendersicht als zufriedenstellend zu bezeichnen. Wir wollten nun schauen, ob eine der häufig eingesetzten Methoden mit einem vertretbaren Aufwand verbessert werden könne, zumal die Anzahl der Proben sehr groß war. Der Versuch war erfolgreich. Ich möchte Ihnen nachfolgend zeigen, wie wir es bewerkstelligt haben, vielleicht können Sie davon profitieren. Die Lösung Abb. 1 stellt die Ausgangssituation dar: „Üblicher“ Methanol/Wasser-Gradient bei 1 ml/min, das Chromatogramm dauerte ohne Spülschritt ca. 16 min. Das war uns für zwei Peaks viel zu lang. Wir haben…

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8. Oktober 2002

Überprüfung der Peakhomogenität – die etwas aufwendigeren Maßnahmen

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über schnelle Möglichkeiten zur Überprüfung der Peakhomogenität nach einer erfolgten Trennung unterhalten. Dabei blieb des chromatographische System mehr oder weniger unverändert. Heute geht es um etwas aufwendigere Maßnahmen. Die Lösung 1. Änderung des Eluenten Zweifelsohne ist eine pH-Wert-Änderung die effektivste Möglichkeit, die Selektivität von ionischen oder auch von lediglich polaren Analyten zu verändern. Vorschlag: ± 0,5 oder ± 1 pH-Einheit bei sonst konstanten Bedingungen. Als zweite, relativ einfache Möglichkeit wäre folgende zu nennen: Belassen Sie es bei dem ursprünglichen pH-Wert, stellen jedoch jenen mit einer anderen Säure/Base ein, z. B. statt mit…

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9. Mai 2002