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B Optimierung

Generische Gradienten in der RP-HPLC II

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall In diesem Tipp hatte ich Ihnen einige Faustregeln und Erfahrungswerte vorgestellt, mit deren Hilfe man eigene, der Fragestellung passend generische Gradienten entwickeln kann. Hier möchte ich Ihnen einige Beispiele zeigen, bei Bedarf folgt eine kurze Erläuterung. Diese Chromatogramme stammen im Wesentlichen aus umfangreichen Untersuchungen, die Hans-Joachim Kuss durchgeführt hat. Die Lösung Die ausgesuchten Beispiele befassen sich mit den Fragen „Start % B“ und „Steilheit“ Die oft angewandte Praxis, mit „viel“ Prozent Wasser/Puffer zu starten, ist selten zweckdienlich, denn: Ein Starten mit hohem wässrigen Anteil führt dazu, dass alle Peaks auf der stationären Phase quasi „festgehalten“ und im Chromatogramm…

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Generische Gradienten in der RP-HPLC I

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel

Der Fall Gradientelution ist den Königsweg bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe in der RP-HPLC. Ein Gradientenlauf ist ferner der erste – und mangels Zeit oft auch der einzige – Schritt, wenn es um eine schnelle Information geht, so beispielsweise bei der Reaktionskontrolle. Vielerorts haben sich nun sogenannte generische Gradienten etabliert: Ein generischer Gradient ist ein Gradient, der sich für meine, immer wieder zu analysierenden, recht ähnliche Substanzen und meine Zielsetzung als geeignet erwiesen hat. So ist beispielsweise „0,1-0,05% TFA/ACN“ für viele Fragenstellungen ein bewährter Gradient. Über solche Gradienten und Faustregeln, die sich in der Praxis als praktikabel erwiesen haben,…

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Wenn schon Druck, dann wenigstens so, dass es für Dich lohnt…

Von B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall UHPLC-Anlagen erlauben hohe Drücke. Solche ergeben sich, wenn beispielsweise eine lange oder eine dünne Säule und/oder kleine Teilchen verwendet werden oder aber wenn bei niedrigen Temperaturen gearbeitet wird. Mit dünnen Säulen wird eine gute Massenempfindlichkeit erzielt, eine niedrige Temperatur ist oft hilfreich bei der Trennung von Enantiomeren oder Isomeren. Wenden wir uns zunächst dem Ziel, „besser trennen“, zu. Nehmen wir an, in einem gegebenen Fall ist eine Verbesserung der Auflösung über die Selektivität kaum möglich, da unsere Probe zwei sehr ähnliche Komponenten enthält. Hier ist eine Verbesserung der Auflösung nur über eine höhere Bodenzahl zu realisieren, eine solche…

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Trennung von polaren Analyten in der RP-HPLC

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Vorsäule

Der Fall Nehmen wir an, Ihre Peaks, die ab ca. der 3-fachen Totzeit eluieren (also ab einem Retentionsfaktor von k = 3, was genügend starke Wechselwirkungen bedeutet), werden ordentlich getrennt. Kopfzerbrechen bereiten Ihnen eher die polaren Komponenten, die direkt nach der Totzeit eluieren – ihre Trennung sei dürftig. Verständlicherweise möchten Sie ungerne gleich die gesamte Methode verändern. Was wäre nun zu tun? Die Lösung Für die Verbesserung der Trennung von polaren Komponenten in der RP-HPLC könnte man sich einen 3-Stufen-Plan mit zunehmendem Aufwand vorstellen: Einfache Maßnahmen – Manipulation (im positiven Sinne!) der Probelösung – Probelösung polarer machen, um eine „On…

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Ungewöhnlich aber erfolgreich…

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, polare Komponenten

Der Fall Zwischen den Jahren habe ich einen Nebenraum meines Büros aufgeräumt. Wie oft in solchen Fällen fand ich manches Interessante, u. a. auch längst vergessene Messungen. Beim Durchblättern der verstaubten Ordner ist mit folgendes abermals bewusst geworden: Früher hat man auch ungewöhnliche Sachen einfach ausprobiert – auch als „normale(r)“ Anwender(in), nicht nur als forschender Mensch. Die Angst des Scheiterns war früher nicht so stark wie heute, von der zur Verfügung stehenden Zeit gar nicht zu sprechen… Ich gebe Ihnen nachfolgend vier Beispiele. Die Lösung 1. Ionen werden üblicherweise an schwache Ionenaustauscher getrennt, die IC ist seit längerem eine gut…

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Ein HPLC-Tag in einem Entwicklungslabor kurz vor Weihnachten 2035…

Von Apparatur, B Optimierung, Detektor, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe Kolleginnen, liebe Kollegen, lasst uns für einen Moment zurücklehnen und einen Dezember-Tag des Jahres 2035 in einem HPLC-Entwicklungslabor vorstellen. Wie könnte er aussehen? Nachfolgend eine mögliche Variante. Doch zunächst ein Blick auf die im Jahre 2035 herrschende Nomenklatur: Die aus der Vergangenheit bekannte Trenntechnik HPLC bzw. UHPLC heißt seit ca. 6-8 Jahren – also seit Ende der 2020er Jahre – HRLC („High Resolution Liquid Chromatography“). Man hat der Methode nach langem Zögern endlich das Attribut gegeben, das sie tatsächlich charakterisiert: Bei einer Trenntechnik steht die Auflösung („Resolution“) im Vordergrund; Die „Bodenturner“, vor allem diejenigen der Geräte-/Säulen-Anbieter, haben sich zwar…

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Schnellexperimente zur Verbesserung der Peakform und/oder der Auflösung

Von Auflösung, B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Sie befinden sich gegen Ende Ihrer Optimierungsbemühungen, Sie haben eine neue Methode entwickelt oder eine bestehende verbessert. Das Ganze sieht recht vernünftig aus aber 2 oder 3 Peaks sind nicht optimal abgetrennt oder eine mögliche Verunreinigung erscheint an dem Hauptpeak als Buckel. Sie haben eigentlich keine Lust mehr, und/oder auch keine Nerven, und/oder keine Zeit, großartig weitere aufwendige Sachen zu testen. Sie sind also bestenfalls bereit, sagen wir, ungefähr noch einen Tag für dieses Trennproblem zu investieren. Dann sollte aber Schluss sein. Welche relativ einfachen Dinge könnte man in diesem Fall ausprobieren, die vielleicht etwas „bringen“ könnten? Die…

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Die Vorsäule – nicht nur als „Vorsäule“ zu nutzen…

Von B Optimierung, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Säule, Veränderung der Peakfläche, Vorsäule

Der Fall Mit einigen Anwendern habe ich vor Ort ein Paar einfache Optimierungsexperimente durchgeführt. Wir haben einiges ausprobiert, nachfolgend werden 1-2 Ergebnisse vorgestellt. Uns ging es vor allem um die Frage: Was ist mit einfachen Mitteln möglich und was „bringt“ wann, was? Die Lösung Vorbemerkung: In den Abbildungen weiter unten werden Chromatogramm-Ausschnitte aus längeren Läufen gezeigt. Man betrachte Abb. 1. Es handelt sich um die Injektion von 50 µl einer recht komplexen Probe (Linearer Puffer/ACN-Gradient, Fluss: 1,6 ml/min, Kromasil C18, 5µm). Abb. 1 Injektion einer 50 µl Probe bei F=1,6 ml/min, Details, siehe Text Im vorliegenden Fall interessiert am meisten…

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Wie kann die Bodenzahl erhöht werden?

Von Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Halten wir zunächst folgendes fest: Eine Erhöhung der Selektivität stellt mit Abstand die effektivste Maßnahme dar, um die Auflösung zu verbessern. Folglich sollte diesem Schritt als erstem die ganze Aufmerksamkeit zu Beginn einer Methodenoptimierung geschenkt werden. Wenn jedoch eine Verbesserung der Selektivität mit einem vertretbaren Aufwand nicht zu erzielen ist, wäre die Erhöhung der Bodenzahl der zweitbeste Weg. Welche Möglichkeiten gibt es nun, dies zu erreichen und welche Maßnahme „bringt“ wie viel? Die Lösung In Abb. 1 sind die Möglichkeiten zusammengefasst, die zu einer Erhöhung der Bodenzahl führen. Symbol-Erklärung: N: Bodenzahl R: Auflösung („Resolution“) S/N: Peak/Rausch-Verhältnis („Signal to…

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In wie weit beeinflusst die Probelösung die Auflösung?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Im diesem Tipp haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probelösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit auch auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probelösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Hier möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probelösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probelösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer…

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