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B Optimierung

Nicht-endcappede Phasen – „ad acta“ legen?

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl neuartiger C18-Phasen eingeführt. Da wären beispielhaft zu nennen: Chemisch geschützte („embedded“ phases), hydrophil endcappte sowie Mixed Mode Phasen und was die Matrix betrifft: Hybrid-, Core Shell-, monolithische Phasen. Diese Materialien weisen vielfach Vorteile auf. Heißt es nun, dass bei der Entwicklung einer neuen Methode der Einsatz einer solchen modernen Phase die richtige Wahl ist? Sollte man also nicht-endcappede Phasen als alte Technologie „ad acta“ legen? Die Lösung Nein. Für die Trennung von Substanzen mit ähnlicher Hydrophobie, aber mit Unterschieden in der Anordnung von Substituenten am Molekül oder von Doppelbindungen in einer…

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5. April 2000

Wie trenne ich Säuren mittels RP C18?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten

Der Fall Nehmen wir an, Sie möchten organische Verbindungen mit saurem Charakter trennen. Die Rede ist nicht von Aminosäuren oder organischen/anorganischen Säuren. Für diese Substanzklassen existieren sehr gute Standardapplikationen. Bei Ersteren erfolgt die Trennung durch Vor- beziehungsweise Nachsäulederivatisierung und Gradientelution. Letztere werden an starken/schwachen Ionenaustauschern getrennt. Welche RP-Systeme könnten nun in Frage kommen? Die Lösung Man nehme wie folgt: Die Säule Nicht endcappede, „klassische“ Säulen, weil diese im Sauren, siehe weiter unten, stabiler als endcappede sind oder einige moderne, speziell für den Einsatz im Sauren entwickelte Säulen, es sei hier je ein Vertreter genannt: LiChrospher, Zorbax SB. Der Eluent Es…

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5. Februar 2000

Entwicklung einer RP-Trennung – die „2 –Tage-Methode“: Säulen- und Eluentenauswahl

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

These: Es ist realistisch, eine Methode innerhalb von zwei Arbeitstagen zu ca. 80% zu entwickeln. Betrachten wir folgenden fiktiven Fall (Siehe für eine  kürzer-gefasste Version dieses Konzepts diesen HPLC-Tipp): Der Fall Ihr Chef kommt Dienstag Morgen recht konsterniert ins Labor, überreicht Ihnen eine ganz, ganz wichtige Probe direkt aus der Synthese und fleht Sie an, eine Trennung bis morgen Abend irgendwie hinzukriegen. Er fliegt am Donnerstag früh in die Staaten und bräuchte dringend die Information über die Anzahl der Probenbestandteile, es geht also um qualitative Analyse. Eigentlich ist Ihr Chef ein netter Mensch und das ist nicht seine Art, also…

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8. Januar 2000

Miniaturisierung ja – aber was ist in der Routine wirklich machbar und sinnvoll?

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Peakverbreiterung, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Miniaturisierung ist aus wirtschaftlichen und analytischen Gründen häufig ein vernünftiger Ansatz. Was ist nun mit einem „normalen“ Gerät machbar und wann lohnt es sich? Die Lösung Vorbemerkung Für folgende Fälle kann ich die Skepsis mancher Kollegen gegenüber Miniaturisierung nachvollziehen und teilweise sogar teilen: Stark regulierte Umgebung, matrixbelastete Proben und/oder große Anzahl an Komponenten, keine HPLC-Spezialisten in Routine-/Betriebslabors, knappe Zeit, um auftretenden Fehlern nachzugehen, usw.. Das bedeutet keinesfalls, dass in solchen Fällen Miniaturisierung nicht sinnvoll ist, es heißt nur, dass vor einer „Ja/Nein“-Entscheidung eine nüchterne Analyse mit objektiven und belegbaren Vor-/Nachteilen unabdingbar ist, z. B: Was gewinne ich an…

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14. Dezember 1999

Peaks kommen zu früh – was tun?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, polare Komponenten

Der Fall Nehmen wir an, ein Peak (oder verstecken sich mehr darunter?) kommt in einem RP-System (C18, ACN/Phosphatpuffer 30/70) zu früh. Es handelt sich offensichtlich um eine oder mehrere sehr polare Komponenten. Wie kann nun dessen/deren Retentionszeit erhöht werden? Die Lösung Chromatographische Parameter verändern: Längere Säule, langsamerer Fluss, niedrige Temperatur – das sind Stoff-unspezifische, recht schnell zu realisierende Massnahmen. Stationäre Phase verändern: – Material mit kleinerem Porendurchmesser einsetzen, z. B. Si 60 Å, statt Si 120 Å; dadurch nimmt die spezifische Oberfläche zu und demnach auch die Wechselwirkungen. – Nicht-endcappedes Material einsetzen. Die (vermeintlich) ionischen Komponenten können mit freien Silanolgruppen…

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8. Juli 1998

Die „Last“ mit den kleinen Peaks

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, kleine Peaks

Der Fall „Small is beautiful“. Das mag stimmen bei Kindern, Katzen, Hunden, Marienkäfern und Ähnlichem. Bei den Teilchen einer Packung sicherlich auch. Beim Häuschen im Grünen ging’s vielleicht auch noch, beim Auto kommen die ersten Zweifel auf. Spätestens bei Peaks hört die Zustimmung für obigen Spruch auf. Wie man solche „vergrößern“ kann, ist ausführlich im Tipp zur Nachweisgrenze beschrieben. Was ist nun wirklich das Problem mit den kleinen Peaks? Die Lösung Halten wir zunächst folgende Tatsache fest: Kleine Peaks, die nicht erkannt werden, führen zu falschen Aussagen über die Reinheit von Proben. Gibt es nun Probleme im Fall von Peaks, die…

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14. April 1998

Unbekanntes Trennproblem – wie soll ich anfangen?

Von ACN, B Optimierung, HPLC-Tipps, Nicht berücksichtigen, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Wasser

Der Fall Gehen wir von dem Fall aus, dass Sie eine Trennung „hinkriegen“ sollen. Dass die Zeit drängt, brauchen wir nicht zu erwähnen und dass Sie wenig über die Probe wissen, ist ebenfalls logisch….. Dass weiterhin die einzige HPLC-erfahrene Kollegin in Urlaub ist, versteht sich von selbst und der Laborleiter, der zufällig ein HPLC-Experte ist, weilt auf einer HPLC-Tagung und anschließend in Kur. Sie also, mutterseelenallein im Labor, ein Fläschchen mit einem unbekannten Etwas in der Hand und auf dem Schreibtisch ein Zettel mit einem riesigen EILT!. Wie sollte man so etwas anpacken – vorausgesetzt, Sie gehen nicht gleich nach…

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8. März 1998

Zusätze im Eluenten

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Bei der Herstellung von Eluenten werden immer wieder bestimmte Zusätze (Additiva, „Modifier“) verwendet. Das sind kleine Mengen bestimmter Substanzen – in der Regel im Promille- oder im unteren Prozentbereich -, die einem meist binären Eluenten zugesetzt werden. Wann ist dies notwendig und was bewirken diese Zusätze? Die Lösung Die HPLC-Trickkiste ist unerschöpflich. Die Hauptziele dabei sind: eine bessere Peakform und eine Änderung der Selektivität. Nachfolgend finden Sie in tabellarischer Form für häufige Anwendungen bewährte Zusätze. Häufige Zusätze im Eluenten Das Fazit Kleine Zusätze haben oft eine große Wirkung. In Hinsicht auf Robustheit beachten Sie bitte jedoch folgendes: Nach…

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8. Juli 1997

Trennung einer unbekannten Probe in einem RP-­C18-System – wie gehe ich vor?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, Säulenauswahl

Der Fall Nehmen wir an, Sie möchten eine mehr oder weniger unbekannte Probe in einem RP-C18-Sy­stem chromatographieren. Wie sollen Sie nun das chromatographische System aussuchen? Betrachten wir das Ganze aus einem etwas anderen Blickwinkel als in diesem HPLC-Tipp. Die Lösung Nachfolgend erholten Sie einen groben Grund-­Leitfaden, der  – je nach individuellen Gegeben­heiten  – weiter „verfeinert“ werden kann. 1. Grundvoraussetzungen Probe im Eluenten (H2O/MeOH bzw. H2O/ ACN) wenigstens teilweise löslich Molekulargewicht für isokratische Trennungen vorzugsweise bis ca. 400-500. Molekulargewicht für Gradiententrennungen bis ca. 2000-3000. Wenn das Molekularge­wicht unbekannt ist, bedienen Sie sich folgen­den Tricks: Elution vor t0 (Totzeit) bedeutet, dass die Probe ausgeschlossen…

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8. Mai 1997

Wie optimiere ich eine Gradiententrennung?

Von B Optimierung, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Eine Gradiententrennung ist am effektivsten über das Gradientenprofil, die Steigung des Gradienten und das Gradientenvolumen zu optimieren. Eine gewünschte Auflösung in kurzer Zeit ist oft erst nach Verlassen der üblichen linearen Gradienten zu erreichen. Denken Sie daher auch an konvexe, konkave oder zusammengesetzte lineare Gradientenkurven mit isokratischen Stufen dazwischen – allerdings: Steht Methodentransfer ins Haus würde ich bei linearen Gradienten bleiben. Zum Herausfinden eines optimalen Gradienten leisten Optimierungsprogramme wie z. B. DryLab, Fusion QbD und ChromSword wertvolle Hilfestellung. Die zweite Optimierungsmöglichkeit ist die Änderung des Gradientenvolumens. Schauen wir uns diese zweite Möglichkeit an, ist sie doch auch ohne…

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21. Januar 1997