Der Fall Selbstverständlich verwenden wir alle Lösungsmittel mit ausgewiesener HPLC-Qualität. Dennoch gibt es immer wieder im Alltag Probleme mit ihnen – was sind die wichtigsten Ursachen dafür? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: In einem HPLC-Labor können Lösungsmittel mit folgenden Qualitätssiegel u.a. zum Einsatz kommen: „HPLC-Grade“, „Gradient-Grade“, „UHPLC-Grade“, „zur Spektroskopie“. Die unterschiedlichen Bezeichnungen suggerieren eine unterschiedliche Reinheit per se, was jedoch nicht immer der Fall ist: So liegt manchmal der Unterschied zwischen „Gradient-Grade“ und „zur Spektroskopie“ in den zusätzlichen Prüfungen auf Reinheit und zwischen „HPLC-Grade“ und „UHPLC-Grade“ nur in dem zusätzlichen Filtrieren über 0,2 µm-Filter – der Herstellungsprozess…
Der Fall Wir wissen alle, was der Unterschied zwischen isokratischen und Gradientrennungen ist: Bei isokratischen Trennungen bleibt die Zusammensetzung des Eluenten während der Gesamttrennung konstant, bei Gradiententrennungen erhöht sich permanent die Elutionsstärke; so nimmt beispielsweise bei RP-Trennungen vom Anfang bis Ende des Laufs der MeOH- bzw. ACN-Anteil der mobilen Phase zu – die Wechselwirkungen zwischen Eluent und stationärer Phase nehmen ebenfalls zu – und die Peaks werden nach vorne „geschoben“. So weit so gut. Wo liegen nun aus praktischer Sicht die Unterschiede zwischen beiden Trennmodi? Die Lösung Der Unterschiede gibt es zu Genüge, nachfolgend die Wichtigsten inkl. kurzer Kommentierung: Peakform…
Der Eluent ist eine schier unendliche Geschichte… 1. Von „Gebirgen“ in der Basislinie und Läufe im Sommer und im Winter imfalle von ACN/Wasser-Eluenten Der Fall Sagen wir, Ihnen ist aufgefallen, dass Sie im Sommer mit ACN/Wasser- bzw. Puffer-Gemischen mehr Probleme haben als im Winter: Basislinieschwankungen, evtl. zusätzliche, breite Peaks etc. Mögliche Erklärung: Eine frisch hergestellte Mischung beispielsweise von 85/15 ACN/Wasser- bzw. Puffer ist bekanntlich kalt und wir haben zunächst auch keine Probleme. Es kann nun passieren, dass im Sommer trotz Klima-Anlage die Temperatur im Labor 27-29 °C beträgt. Die höhere Temperatur begünstigt die Bildung von Polymeren – ein bekanntes Problem…
Tipps rund um den Eluenten Es hat sich gezeigt, dass imfalle von ternären Mischungen bei bestimmten Mischverhältnissen die Dichtungen „streiken“, z. B: Eine Mischung 25/25/50 MeOH/ACN/Wasser führt zu Leckagen, nach dem Wechsel jedoch zu einer Mischung 10/40/50 MeOH/ACN/Wasser ist wieder alles in Lot Die Peakform von basischen Analyten lässt manchmal auch bei Verwendung von modernen stationären Phasen zu wünschen übrig. Durch eine Erhöhung der Ionenkonzentration im Eluenten wird die Peaksymmetrie besser, man möchte allerdings nicht unbedingt die Pufferstärke verändern, was ja auch Erhöhung der Ionenkonzentration bedeuten würde. Man könnte nun folgendes tun: Zum Wasser (oder zum Puffer) werden ca. 2…
Der Fall Vor Längerem schockierte eine plötzlich aufgetretene ACN-Knappheit den Markt. Hier aber auch in Broschüren und auf den Webseiten nahezu aller großen Anbieter wurden damals diverse Vorschläge zur (M)Linderung des Problems diskutiert. Die Brisanz des Problems ist heute Geschichte, die hohen Preise dagegen sind geblieben. Ein derartiges Scenario kann sich jedoch wiederholen. Wie auch immer, ist in das Bewusstsein der Anwender durch diese Situation folgendes Ziel wesentlich stärker gerückt: Der Lösungsmittelverbrauch soll möglichst reduziert werden – das gebietet neben ökonomischen Gründen auch unsere Verantwortung gegenüber der Natur – man bräuchte also brauchbare Alternativen zu ACN. Mich hat nun die…
Verschiebung der Retentionszeit (2) Im diesem Tipp haben wir uns mit der Verschiebung der Retentionszeit beschäftigt, die Ursachen lagen in einer Veränderung der stationären Phase im Sinne der „Chemie“. Hier werden wir uns Änderungen der mobilen Phase widmen. Auch in diesem HPLC-Tipp geht es um ungewollte Veränderungen, also um solche, die nicht vom Anwender bewusst vorgenommen wurden, z. B. Eluenten-Zusammensetzung oder pH-Wert verändert. Nachfolgend werden einige Gründe für eine veränderte Eluenten-Zusammensetzung genannt. Sie resultieren durch kleine, ungeachtete/unbedachte Variationen beim Ansetzen der mobilen Phase oder während der Trennung. Ein Eluent wird z. B. manchmal dadurch hergestellt, dass der Puffer und die…
Der Fall Vor längerer Zeit schon kam unerwartet ein großes Problem auf uns zu: ACN-Knappheit. Da das Problem hinreichend bekannt ist, möchte ich nicht auf Details eingehen, vielmehr wollen wir uns über mögliche Auswege unterhalten, sollte das Problem in einer globalisierten Welt wieder auftauchen. Es ist nicht verkehrt, sich um Lösungsmittelverbrauch in der HPLC im allgemeinen und ACN im speziellen Gedanken zu machen. Welche Möglichkeiten gibt es nun, den ACN-Verbrauch zu vermeiden oder wenigstens zu senken? Die Lösung Nachfolgend werden mögliche Lösungsansätze mit kurzer Stellungnahme/Kommentierung vorgestellt: Auf alternative ACN-Distributoren ausweichen Vielleicht lohnt es sich, gezielte Internet-Recherchen zu starten; so war…
Eluent im weitesten Sinne Mikroorganismen In MeOH/H2O/H3PO4-Gemischen können Algen recht schnell wachsen, ist dagegen ACN als organisches Lösungsmittel zugegen, passiert dies eher selten. In H2O/Essigsäure bzw. in Acetatlösungen existiert dieses Problem ebenso, denn für manche Mikroorganismen stellen Acetate, insbesondere Ammoniumacetat, ein Leckerbissen dar. Wie auch immer, denken Sie daran, eine UV-Lampe verhindert Algenwachstum Folgender Fall: Sie haben festgestellt, dass Sie montags Vormittag häufiger Probleme mit Geisterpeaks haben als sonst die Woche über. Möglicher Grund: Natürlich läuft Ihre Milliporeanlage für das HPLC-Wasser über´s Wochenende. Weil allerdings kaum jemand am Wochenende Wasser entnimmt, kann sein, dass an der Entnahmestelle Mikroorganismen wachsen können…
Der Fall Manche AnwenderInnen arbeiten im Gradienten-Modus mit vorgemischten Eluenten, manche legen jeweils 100% A (z. B. Puffer) und 100% B (z. B. ACN) vor und lassen das Gerät die gewünschte Mischung herstellen. Mit nicht-vorgemischten Eluenten kann es zu Problemen kommen, welche wären das und warum? Die Lösung Wenn 100% Puffer und 100% ACN zusammengeführt werden, besteht die Gefahr, dass in dünnen Kapillaren Salze ausfallen (z. B. ab ca. 85% ACN und mehr als 30-30 Mmol Puffer) Wird ein Gradient von 100% A auf 100% B gefahren, herrscht nicht nur der beabsichtigte Lösungsmittelgradient, sondern gleichzeitig ein pH-Wert- und ein Salzgradient….
Der Fall Wir haben uns bereits in diesem HPLC-Tipp über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der „Front“ veranlassen mich jedoch ein zweites Mal das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 x 4 mm, Fluss, 1 ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13-14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min x 20 min = 20 ml und 1,5…