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HPLC-Tipps

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Ein HPLC-Tag im Dezember 2014

Von HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe Leserinnen, liebe Leser, diesen HPLC-Tipp habe ich im Dezember 2004 geschrieben und einen (nicht ganz ernst gemeinten und bewusst übertriebenen) Blick auf die HPLC des Jahres 2014 skizziert. Es ist zwar heute alles „Schnee von gestern“ aber als „historischen“ Text lasse ich auch diesen Tipp in unserer Datenbank drin… „Es kommt nicht darauf an, die Zukunft vorherzusagen, sondern auf die Zukunft vorbereitet zu sein“ Perikles Getreu unserer Tradition werden wir in der Dezember-Ausgabe uns nicht mit Fachlichem im strengeren Sinne beschäftigen, sondern einem Thema in einer etwas lockeren Art nähern und somit das Jahr ein wenig ruhig ausklingen lassen….

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7. Dezember 2004

Von 100% wässriger zu 100% organischer Phase – mögliche Probleme bei Gradientenläufen

Von A Fehlersuche, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Manche AnwenderInnen arbeiten im Gradienten-Modus mit vorgemischten Eluenten, manche legen jeweils 100% A (z. B. Puffer) und 100% B (z. B. ACN) vor und lassen das Gerät die gewünschte Mischung herstellen. Mit nicht-vorgemischten Eluenten kann es zu Problemen kommen, welche wären das und warum? Die Lösung Wenn 100% Puffer und 100% ACN zusammengeführt werden, besteht die Gefahr, dass in dünnen Kapillaren Salze ausfallen (z. B. ab ca. 85% ACN und mehr als 30-30 Mmol Puffer) Wird ein Gradient von 100% A auf 100% B gefahren, herrscht nicht nur der beabsichtigte Lösungsmittelgradient, sondern gleichzeitig ein pH-Wert- und ein Salzgradient….

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7. November 2004

LC-MS-Kopplung – Die Eigenarten der wichtigsten Interfaces, Schlussfolgerungen

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Es liegt auf der Hand, dass das Interface das Herzstück der LC-MS-Kopplung darstellt, hängt doch von seinem „Können“ Empfindlichkeit und Spezifität der Aussage ab. Es ist weiterhin klar, dass durch den unterschiedlichen Aufbau und die Funktionsweise auch unterschiedliche Aspekte wichtig bzw. kritisch sind. Welche Dinge sollte man sich aus Anwendersicht merken? Die Lösung 1. Elektrospray (ESI) Die Ionisierung des Analyten erfolgt via pH-Wert, optimal ist ein pH-Wert um +/- 0,5 pH-Einheiten vom pKs-Wert entfernt Das organische Lösungsmittel beeinflusst die Ionisation nur gering – verwenden Sie MeOH oder ACN je nach chromatographischer Notwendigkeit Hoher organischer Anteil im Eluenten verhindert…

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7. Oktober 2004

LC-MS-Kopplung – Matrix-Einfluss, das Problem der Empfindlichkeit

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Die LC-MS-Kopplung wird naturgemäß – abgesehen von Spezialfällen wie z. B. LC-MS als „Peakseparator“ für Fraktionierungen in der präparativen HPLC – zur Überprüfung der Peakhomogenität und zur Substanzidentifizierung eingesetzt. Dies geschieht häufig im Spurenbereich, z. B. Zersetzungs- und Nebenprodukte, Metabolite, unbekannte Verunreinigungen (Target/Non-Target-Analytik). In solchen Fällen gilt, jeglichen Verlust an Empfindlichkeit zu vermeiden. Welche Möglichkeiten gibt es nun dafür? Die Lösung Nachfolgend sind einige Hinweise stichwortartig aufgelistet. Matrix Überprüfen Sie eine evtl. Ionisationsunterdrückung durch die Matrix: Eine Standardlösung wird mit Hilfe einer zweiten Pumpe und eines T-Stückes dem Eluenten nach der Säule zudosiert. Nachdem die Basislinie konstant ist,…

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7. September 2004

LC-MS-Kopplung – wie mache ich aus einer HPLC- eine LC-MS-Methode?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Vorbemerkung Die LC-MS-Kopplung wird immer wichtiger. War diese Technik noch Anfang der 2000er Jahre eine Rarität von und für Spezialisten, wird sie zunehmend zu einer Notwendigkeit in Entwicklungslabors, auch in der Routine gewinnt sie an Bedeutung: Routine-LC-MS-Geräte sind in der Zwischenzeit günstig, kompakt, robust und arbeiten recht zuverlässig. Aus diesem Grunde habe ich mich entschlossen, auf einige der häufigsten Fragen, die mir bzgl. LC-MS gestellt werden, in hiesigen sowie in diesem und in diesem HPLC-Tipp in komprimierter Form und aus praktischer Sicht einzugehen. Selbstverständlich bedarf es für eine detaillierte Auseinandersetzung mit dieser Technik des Besuchs entsprechender Seminare bzw. des Studiums von Infomaterial…

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7. August 2004

Überprüfung der Robustheit von Systemen mit gepufferten Eluenten

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, Robustheit, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Je komplexer der Mechanismus bei der Wechselwirkung eines Analyten mit der stationären Phase ist, um so labiler sind die Gleichgewichte, um so anfälliger ist die Methode. Mit anderen Worten: Die Robustheit in solchen Systemen ist ein durchaus kritischer Punkt. Es ist sicherlich bekannt, dass im Rahmen der Überprüfung der Robustheit von Methoden mit gepufferten Eluenten u.a. auch der pH-Wert im relevanten Bereich variiert werden sollte. Wie kann man hier ökonomisch vorgehen? Die Lösung Besorgen Sie sich die pKs-Werte Ihrer Substanzen! Wenn diese nicht vorliegen, lohnt es sich schon beim Auftraggeber nachzufragen oder bei Bedarf jene mit Hilfe der…

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7. Juli 2004

Passivieren mit Salpetersäure – Details und Hinweise

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Passivieren mit 6 N HNO3 ist ein altes, bewährtes Mittel, um erstens die Anlage gründlich zu reinigen und zweitens die Oberfläche von Stahl (Pumpe, Kapillaren etc. ) zu passivieren – also praktisch inert zu machen. Ich höre jedoch bei Seminaren oder vor Ort häufiger Klagen, wie: „Nachher hat nichts mehr funktioniert, wir mussten sämtliche Dichtungen auswechseln“, „Das Neutralspülen hat 3 Tage gedauert“, „Wir hatten nach der Behandlung mit der Salpetersäure jede Menge Geisterpeaks gehabt“ und vieles dergleichen. Das ist alles richtig und diese Probleme treten tatsächlich auf, wenn bestimmte Sachen nicht beachtet werden. Was wären das? Die Lösung…

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7. Juni 2004

Bei kleinem Fluss keine Probleme, bei erhöhtem schon – was kann die Ursache sein?

Von A Fehlersuche, Apparatur, Fluss, Fritten, HPLC-Tipps

Der Fall Sie arbeiteten bis dato beispielsweise bei einem Fluss von 0,8 mL/min und hatten keine Probleme mit Luftblasen. Nachdem nun die (einfache) Trennung Ihnen zu lange dauert, beschließen Sie nach dem OK Ihres Chefs den Fluss auf 1,2 oder 1,5 mL/min zu erhöhen. Sie bekommen allerdings jetzt permanent Ärger mit Luftblasen. Wieso? Die Lösung Auch ein gut entgaster Eluent enthält stets etwas Luft. So lange nun die Luft im Eluenten bleibt, stört sie nicht. Wenn allerdings der Eluent durch eine enge Stelle fließen muss, entstehen dort Kavitate und im Bereich dieses partiellen Vakuums kann die Luft inform von kleinen…

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7. Mai 2004

Trennung von sauren Komponenten mittels RP-HPLC

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Die Trennung von basischen ist ein viel, viel schwierigeres Unterfangen als die Trennung von sauren Komponenten. Letzteres Trennproblem ist – stark vereinfacht formuliert – fast ein Kinderspiel. Wie geht nun das „Spiel“? Die Lösung Wir unterhalten uns zunächst über den Eluenten: Der wichtigste Parameter ist mit Abstand der pH-Wert, je nach Stärke der zu trennenden Säuren sollte er sich zwischen ca. 1,5 und 4,0 bewegen. Mit seiner Hilfe können die sauren Komponenten neutralisiert werden, oder allgemein formuliert, deren Ionisierungszustand und damit die Wechselwirkung mit der stationären Phase beeinflusst werden. Der Einsatz von Puffern ist grundsätzlich richtig und sinnvoll,…

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7. April 2004

Dichtungen in der HPLC – was ist hier wichtig?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Dichtungen, HPLC-Tipps

Der Fall Nach den Säulen und noch vor der Detektorlampe unterliegen Dichtungen dem größten Verschleiß in der HPLC. An welche Dinge sollte man hier denken, was ist wichtig? Die Lösung Folgende Sachen erachte ich als erwähnenswert: Dichtungen brauchen – wenn sie neu sind – eine gewisse Zeit, bis sie in Acetonitril-haltigen Eluenten ihren End-Quellzustand erreicht haben. Also: Wenn Sie Dichtungen auswechseln und wenn Sie mit ACN/H2O oder ACN/Puffer als Eluent arbeiten, sollten Sie das Gerät eine Zeit lang laufen lassen, bevor Sie mit der eigentlichen Messung beginnen. Ihre Ergebnisse werden einfach präziser. Oder aber sie bewahren Ihre Dichtungen in Acetonitril…

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1. Februar 2004