Der Fall Stark organische Substanzen (Lipide, große Moleküle etc.) können an RP-Phasen, insbesondere C18, regelrecht ,,kleben“ bleiben. Das Ergebnis ist manchmal ein hoher Rückdruck und fast immer eine Verschlechterung der Trennung. Es kann zu der Bildung von breiten und tailenden Peaks oder auch Geisterpeaks kommen. Man müsste also mit MeOH oder ACN spülen. Das bedarf aber eines gewissen Aufwands und die Zeit ist oft knapp. Was tun? Die Lösung Injizieren Sie 100 μl oder 200 μl MeOH oder ACN. (Überprüfen Sie vorher, ob durch die ACN-Injektion in pufferhaltigen Eluenten kein Niederschlag entsteht!). Sollten sich organische Substanzen an der RP-Oberfläche befinden,…
Warum kann ich polare Substanzen an der einen C18-Säule vernünftig trennen und an der anderen kaum?
Der Fall Sie möchten polare Substanzen mittels RP-Chromatographie trennen. Nehmen wir an, es handelt sich dabei um Säuren, und Sie möchten mehrere Säulen auf ihre Eignung testen. Natürlich machen Sie es richtig und wählen „gute“ Kandidaten, d. h. nachsilanisierte Phasen.* Trotz Ihrer überlegten Wahl erhalten Sie bei gleichen chromatographischen Bedingungen (Eluent, pH-Wert, Temperatur etc.) mit einer Säule vernünftige Chromatogramme, während eine zweite, ebenfalls nachsilanisierte („endcappede“) Säule tailende Peaks liefert. Warum? *Anmerkung: Nachsilanisierte C18-Phasen sind geeignet zur Trennung von polaren Substanzen – jedenfalls was die Peakform betrifft … Das Kieselgel wurde nach der Umsetzung mit dem C18-Alkylsilan, zur Herstellung der RP-Phase,…
Der Fall Bei der Vielzahl an C18-Säulen heute auf dem Markt wäre es unökonomisch, die eine oder andere C18-Säule bei einer neuen Fragestellung auf „gut Glück“ auszutesten. Wenn tatsächlich keinerlei Informationen vorliegen, sollte man versuchen, die Auswahl einzuengen. Dazu gibt es einige Regeln. Die Lösung Folgende Substanzeigenschaften der Probe sind für die ersten Entscheidungen hilfreich: Löslichkeitsverhalten Chemische Natur Molekulargewicht Zunächst sollte entschieden werden, ob für Ihre Probe eine C18-Säule auf Kiesgelbasis in einem klassischen RP-System grundsätzlich in Frage kommt. Anschließend können bestimmte Säulen anhand der Substanzeigenschaften aussortiert werden, und andere wiederum sollten als Kandidaten im Auge behalten werden. Tab. 2.1:…
Der Fall Schauen wir uns die Sache erst einmal bei den Autos an, betrachten wir einige „historische“ Modelle: Beim ,,Cinquecento“ wissen wir, es handelt sich um den kleinen Italiener mit 500 ccm, bei der wilden ,,Ente“, 2 CV, ist die Rede von zwei ,,Pferden“ im Motor, bei ,,quadro“ haben wir es logischerweise mit einem Allradantrieb zu tun. KA, MOKKA und SMART sind dagegen pfiffige Namenskreationen, die nichts über Eigenschaften und Spezifikationen verraten. Ähnlich ist es auch bei den HPLC-Materialien. Was lassen uns die Hersteller wissen? Die Lösung Es gibt Materialbezeichnungen ohne jegliche Informationen, z. B. INTERCHROM, ASAHIPAK, und andere, die…
Der Fall Einige, mehrere oder alle Peaks in Ihrem Chromatogramm eluieren mit einem Tailing. Die Gründe können vielfältig sein: Säulenüberladung, keine optimale Parametereinstellung am Detektor (z. B. Zeitkonstante, Datenrateaufnahme), größeres Totvolumen im System. Oder hängt es letzten Endes doch mit der Säule zusammen? Nehmen wir an, Sie können die ersten drei Fälle als Ursachen ausschließen und das Totvolumen Ihrer Anlage ist auch in Ordnung. Dann betrifft es doch die Säule. Die Frage ist nur: Was genau an der Säule? Wie kann man das überprüfen und was sind schließlich die notwendigen Maßnahmen? Die Lösung Wenn die oben beschriebenen Fälle als Ursachen…
Der Fall Vorbemerkung: Nachfolgende Ausführungen beziehen sich aus praktischer Sicht im Wesentlichen auf isokratische Trennungen. Die Theorie der HPLC gilt sehr wohl auch für Gradiententrennungen, jedoch spielt der Fluss dort eine gänzlich andere Rolle, siehe dazu diesen HPLC-Tipp. Die Fließgeschwindigkeit beeinflusst die Trennung in der HPLC, denn von ihr hängt die Retentionszeit und die Trennleistung (Bodenzahl, Effizienz) einer Säule ab. Durch eine Abnahme des Flusses eluieren die Peaks später und der Abstand dazwischen vergrößert sich. Eine Flusserhöhung bewirkt genau das Gegenteil. Der Zusammenhang zwischen Fluss und Säuleneffizienz wird durch die Van-Deemter-Kurve wiedergegeben siehe Abb. 1. Abb.1: Die Abhängigkeit der theoretischen…
Der Fall Fast in jedem HPLC-Buch wird auf diese Begriffe aus der Theorie der HPLC eingegangen. Fühlt sich jeder Autor irgendwo der HPLC-Theorie verpflichtet oder kann man als „normaler“ Mensch mit diesen Dingen tatsächlich etwas anfangen? Die Lösung Ja, ich denke entschieden ja! Die Reihenfolge einer vernünftigen Vorgehensweise bei der Optimierung in der Sorptions-HPLC lautet prinzipiell: 1) Optimalen k-Bereich einstellen („vernünftige“ Wechselwirkungen/Retention überhaupt) 2) Selektivität verbessern (unterschiedlich stark Wechselwirkungen der zu trennenden Komponenten) 3) Effizienz erhöhen („gute“ Peakform) Aus einem Chromatogramm erkennt man oft, in welchem Stadium der Optimierung man sich befindet. Siehe dazu nachfolgende Tabelle. Der Einfachheit halber gehen…
Der Fall Der Leser möge es mir nachsehen, dass die Frage hier bewusst ungenau formuliert wurde, um exakt darauf hinzuweisen. Bevor ich mit der Optimierung beginne, muss sich genau definieren, was ich denn optimieren möchte. Bei einer Trenntechnik wie der HPLC bedeutet Optimierung in der Regel folgendes: Ich will den Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis vergrößern, d. h. die Auflösung erhöhen => besser trennen Ich will die Retentionszeit verkürzen => schneller trennen Ich will die Nachweisgrenze erniedrigen => mehr sehen Mit der Erniedrigung der Nachweisgrenze und der Verkürzung der Retentionszeit beschäftigen sich dieser (Nachweisgrenze) und dieser (Retentionszeit) Tipp….
Der Fall Nehmen wir an, Ihnen ist eine Trennung gut gelungen. Vielleicht ist die Auflösung sogar viel zu gut. Das ist zu erkennen an dem unnötig großen Abstand zwischen den interessanten Peaks. Oder es dauert sehr lange zwischen Injektion und Elution des ersten Peaks. Der nächste vernünftige Schritt wäre, eine ausreichend gute Trennung bei verkürzter Retentionszeit zu erzielen. Welche Möglichkeiten gibt es dafür? Die Lösung Nachfolgend sind einige einfache und auch etwas aufwendigere Maßnahmen aufgeführt: Maßnahmen zur Erniedrigung der Retentionszeit Kürzere Säule; z. B. liefert eine 100 mm-Säule mit 3 µm-Teilchen und der gleichen stationären Phase eine ähnliche Trennung wie…
Der Fall Ein Peak, der etwa folgendermaßen aussieht: … ist sicherlich keine Wonne. Wie könnte man die Nachweisgrenze erniedrigen, was gleichbedeutend wäre mit einer Verbesserung des Peak/Rauschen-Verhältnisses? Die Lösung Es gibt glücklicherweise eine Reihe relativ leicht zu realisierenden Maßnahmen, die hier schnell zu einem besseren Ergebnis führen. Die einfachsten sind mit einem · versehen, siehe Tab. 1. Tab. 1: Maßnahmen zur Erniedrigung der Nachweisgrenze Das Fazit Wenn Sie ein(e) gelegentlicher(e) oder ständiger(e) Kämpfer(in) im Spurenbereich sind, sind optimale chromatographische Parameter für Sie viel wichtiger als für ,,normale“ Sterbliche. Hier einige Möglichkeiten: Dünne Säulen oder sogar Kapillaren Core Shell (1,3 µm)…