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HPLC-Tipps

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, HPLC-Tipps, Uncategorized, Variationskoeffizient (Vk), Veränderung der Peakfläche

Degasser Große Variationskoeffizienten Vorsicht beim Degasser! Degasser sind praktisch. Nichtdestotrotz sollte man an bestimmte Sachen denken: Die Effektivität des Entgasens ist abhängig vom Fluss, je geringer der Fluss, umso besser arbeitet ein Degasser Schläuche zum Ersten: Die Schläuche werden mit der Zeit porös – vor allem, wenn häufig mit Puffer gearbeitet wird. Betrachten Sie bitte die Schläuche/Membrane als Verschleißteile, je nach verwendeter mobiler Phase sollten sie alle 3-4 Jahre evtl. ausgewechselt werden Schläuche zum Zweiten: Haben Sie trotz gründlichem Spülen ein Problem mit Geisterpeaks? Es kann sein, dass dies mit den Schläuchen im Degasser zusammen hängt. Nicht nur wg. Weichmacher…

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Uncategorized

Schmale und breite Peaks während eines Gradientenlaufs Luft entfernen Bessere Wiederfindungsrate Stärkeres Rauschen oder Geisterpeaks immer um 17.00 Uhr oder nur „gestern“… 1. Schmale und breite Peaks während eines Gradientenlaufs Bekanntlich sehen die Peaks beim Gradienten normalerweise schön aus: Schmal, symmetrisch, im Idealfall bleibt die Peakbreite bei allen Peaks konstant. Nehmen wir jetzt an, Sie fahren einen Gradienten im HILIC-Modus. An einigen Bereichen des Chromatogramms sehen die Peaks gut aus, an einigen Bereichen wiederum erhalten Sie breite Peaks. Mögliche Erklärung: je nach aktueller Eluentenzusammensetzung, die in diesem Moment die Säule erreicht, kann bei der Wechselwirkung der Substanz(en) mit den funktionellen…

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Der Probengeber als Ursache für mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Robustheit, Veränderung der Peakfläche

Der Fall In diesem Tipp haben wir uns über Probleme betreffend den Detektor unterhalten. Hier wollen wir uns anschauen, welche typische Autosampler-Probleme zu einer schlechten Reproduzierbarkeit und/oder falschen Peakfläche führen können. Die Lösung Einige Probleme beeinträchtigen typischerweise die Reproduzierbarkeit der Injektion, d.h. der Vk ist beispielsweise bei einer 6-fachen Injektion aus einem vial nicht zufriedenstellend. Hier wäre als Ursache eine zu schnelle Ansauggeschwindigkeit („Aspiration Rate“ oder „Aspiration Time“) im Falle von viskosen Probelösungen zu nennen, merke: Auch Wasser/Puffer als Probelösung ist recht viskos! Andere Ursachen wiederum führen zu einer falschen Peakfläche. Die irreversible Adsorption an der Nadel wäre ein Beispiel…

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Der Detektor als Ursache für mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche

Von A Fehlersuche, Apparatur, Detektor, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Nehmen wir an, Sie haben folgendes Problem: Sie stellen bei Wiederholmessungen eine schlechte Reproduzierbarkeit der Peakflläche fest oder Sie erhalten bei der Methodenübernahme/dem Methodentransfer einfach eine andere Peakfläche als vorgegeben. Sie können mehrere mögliche Ursachen ausschließen (Autosampler, Stabilität der Probe, Fluss, Memory-Effekt etc.). Es scheint also, dass der Detektor das Problem ist. Woran könnte es nun liegen? Die Lösung Gehen wir davon aus, dass Sie selbstverständliche Sachen überprüft haben bzw. bei Bedarf die wichtigsten Maßnahmen bereits ergriffen haben, z. B: Das Gerät ist natürlich qualifiziert, die Lampenenergie ist OK, die Kalibriergerade mit einer SST-Lösung sieht gut aus, die…

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Einsatz von HPLC-Lösungsmitteln – wieso gibt es trotz „HPLC-Qualität“ Probleme?

Von A Fehlersuche, ACN, Eluent, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Wasser

Der Fall Selbstverständlich verwenden wir alle Lösungsmittel mit ausgewiesener HPLC-Qualität. Dennoch gibt es immer wieder im Alltag Probleme mit ihnen – was sind die wichtigsten Ursachen dafür? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: In einem HPLC-Labor können Lösungsmittel mit folgenden Qualitätssiegel u.a. zum Einsatz kommen: „HPLC-Grade“, „Gradient-Grade“, „UHPLC-Grade“, „zur Spektroskopie“. Die unterschiedlichen Bezeichnungen suggerieren eine unterschiedliche Reinheit per se, was jedoch nicht immer der Fall ist: So liegt manchmal der Unterschied zwischen „Gradient-Grade“ und „zur Spektroskopie“ in den zusätzlichen Prüfungen auf Reinheit und zwischen „HPLC-Grade“ und „UHPLC-Grade“ nur in dem zusätzlichen Filtrieren über 0,2 µm-Filter – der Herstellungsprozess…

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Peaky und Chromy im Gespräch – die Lösung

Von ACN, Bodenzahl, Gradient, HPLC-Tipps, polare Komponenten, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender, In diesem Tipp berichtete ich vom Dialog der zwei Peaks Peaky und Chromy. Nachfolgend zur Erinnerung noch einmal das Gespräch und anschließend die richtige Antworten mit kurzer Kommentierung. Peaky Säure und Chromy von Kieselhausen im Gespräch Peaky: Hör mal Chromy, du bist so groß und mächtig, und hast so´n großes Molekulargewicht und viele funktionelle Gruppen und überhaupt… Dich muss man doch entweder bei kleinen Wellenlängen messen, weil deine viele funktionellen Gruppen dort gut absorbieren oder aber im Interface, weiß´te, da, bei der LC/MS-Kopplung, dich richtig kaputt machen, um dich detektieren zu können – Mensch, bist du…

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Peaky und Chromy im Gespräch…

Von ACN, Bodenzahl, Gradient, HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender, ab und an tauchen die zwei Peaks, Peaky und Chromy, auf – aus dem nichts.  So auch diesmal und da ich zufällig unmittelbar bei in der Nähe stand, habe ich ungewollt ihr Gespräch gelauscht. Wie immer ging´s um ihr Leben in der Säule – und an diesem Tag waren sie irgendwie recht streitlustig. Das ist zwar nicht ganz höflich, aber ich möchte Ihnen ihren Dialog trotzdem nicht vorenthalten. Peaky Säure und Chromy von Kieselhausen im Gespräch Peaky: Hör mal Chromy, du bist so groß und mächtig, und hast so´n großes Molekulargewicht und viele funktionelle Gruppen und…

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Peaks auf einer Flanke – mögliche Konsequenzen und Maßnahmen

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Integration, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Manch´ ein Peak eluiert auf einer Flanke. Die Flanke kann u.a. ein abfallender Gradient, ein sehr langsam eluierender Peak oder einfach Matrix sein. Angenommen, das Problem ist chromatographisch nicht zu lösen, wie könnte man vorgehen, um den Fehler bei der Bestimmung der Peakfläche zu minimieren? Die Lösung Im Falle vom Gradienten haben wir an dieser Stelle bereits darüber gesprochen, wie eine Lösung aussehen könnte: Blindgradient bzw. das Chromatogramm einer Matrixinjektion (Matrixlösung ohne Probe) vom Original-Chromatogramm abziehen und das Differenz-Chromatogramm integrieren. Hier möchte ich kurz auf zwei etwas anders gelagerte Fälle eingehen. Fall 1 In Abb. 1 sind sechs…

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Fluss, Peakhöhe und Peakfläche

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Detektor, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Wenn der Fluss sich ändert, ändert sich auch die Peakform – mal stärker, mal schwächer. So weit so gut. Was machen nun die Peakhöhe und die Peakfläche? Ändern sie sich ebenso und wenn ja, ist dies merklich? Was wären schließlich die Konsequenzen? Die Lösung Es muss grundsätzlich zwischen Konzentrations- und Massen-empfindlichen Detektoren unterschieden werden: Der UV- (UV-Vis, DAD) und der Fluoreszenzdetektor beispielsweise sind Konzentrations-empfindliche Detektoren, der Massendetektor bei der LC/MS- bzw. LC/MS/MS-Kopplung ein Massen-empfindlicher Detektor. D.h. im ersten Fall ist das Signal von der Konzentration, im Zweiten von der Masse der Analyten abhängig. Bei einem Konzentrations-empfindlichen Detektor verändert…

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Die Auflösung – verschiedene Formeln, verschiedene Ergebnisse

Von Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps

Der Fall Die Auflösung ist – vereinfacht gesagt – der Abstand zwischen zweier Peaks an der Basislinie. Sie hängt von der absoluten Stärke der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Kapazität, Retentionsfaktor k), von dem Verhältnis der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Selektivität, Selektivitäts- oder Trennfaktor α) und von der Peakform (Effizienz, Bodenzahl N) ab. Die Auflösung wird als das wichtigste Kriterium für die „Güte“ einer Trennung angesehen. So wird oft eine Mindestauflösung verlangt, auch werden Auflösungen zum Methodenvergleich heran gezogen. Es ist nun so, dass es mehrere Formeln für die Auflösung gibt, die alle mehr oder weniger benutzt werden. Es liegt somit auf…

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