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Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

LC-MS-Kopplung – Die Eigenarten der wichtigsten Interfaces, Schlussfolgerungen

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Es liegt auf der Hand, dass das Interface das Herzstück der LC-MS-Kopplung darstellt, hängt doch von seinem „Können“ Empfindlichkeit und Spezifität der Aussage ab. Es ist weiterhin klar, dass durch den unterschiedlichen Aufbau und die Funktionsweise auch unterschiedliche Aspekte wichtig bzw. kritisch sind. Welche Dinge sollte man sich aus Anwendersicht merken? Die Lösung 1. Elektrospray (ESI) Die Ionisierung des Analyten erfolgt via pH-Wert, optimal ist ein pH-Wert um +/- 0,5 pH-Einheiten vom pKs-Wert entfernt Das organische Lösungsmittel beeinflusst die Ionisation nur gering – verwenden Sie MeOH oder ACN je nach chromatographischer Notwendigkeit Hoher organischer Anteil im Eluenten verhindert…

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LC-MS-Kopplung – Matrix-Einfluss, das Problem der Empfindlichkeit

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Die LC-MS-Kopplung wird naturgemäß – abgesehen von Spezialfällen wie z. B. LC-MS als „Peakseparator“ für Fraktionierungen in der präparativen HPLC – zur Überprüfung der Peakhomogenität und zur Substanzidentifizierung eingesetzt. Dies geschieht häufig im Spurenbereich, z. B. Zersetzungs- und Nebenprodukte, Metabolite, unbekannte Verunreinigungen (Target/Non-Target-Analytik). In solchen Fällen gilt, jeglichen Verlust an Empfindlichkeit zu vermeiden. Welche Möglichkeiten gibt es nun dafür? Die Lösung Nachfolgend sind einige Hinweise stichwortartig aufgelistet. Matrix Überprüfen Sie eine evtl. Ionisationsunterdrückung durch die Matrix: Eine Standardlösung wird mit Hilfe einer zweiten Pumpe und eines T-Stückes dem Eluenten nach der Säule zudosiert. Nachdem die Basislinie konstant ist,…

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LC-MS-Kopplung – wie mache ich aus einer HPLC- eine LC-MS-Methode?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Vorbemerkung Die LC-MS-Kopplung wird immer wichtiger. War diese Technik noch Anfang der 2000er Jahre eine Rarität von und für Spezialisten, wird sie zunehmend zu einer Notwendigkeit in Entwicklungslabors, auch in der Routine gewinnt sie an Bedeutung: Routine-LC-MS-Geräte sind in der Zwischenzeit günstig, kompakt, robust und arbeiten recht zuverlässig. Aus diesem Grunde habe ich mich entschlossen, auf einige der häufigsten Fragen, die mir bzgl. LC-MS gestellt werden, in hiesigen sowie in diesem und in diesem HPLC-Tipp in komprimierter Form und aus praktischer Sicht einzugehen. Selbstverständlich bedarf es für eine detaillierte Auseinandersetzung mit dieser Technik des Besuchs entsprechender Seminare bzw. des Studiums von Infomaterial…

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Trennung von sauren Komponenten mittels RP-HPLC

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Die Trennung von basischen ist ein viel, viel schwierigeres Unterfangen als die Trennung von sauren Komponenten. Letzteres Trennproblem ist – stark vereinfacht formuliert – fast ein Kinderspiel. Wie geht nun das „Spiel“? Die Lösung Wir unterhalten uns zunächst über den Eluenten: Der wichtigste Parameter ist mit Abstand der pH-Wert, je nach Stärke der zu trennenden Säuren sollte er sich zwischen ca. 1,5 und 4,0 bewegen. Mit seiner Hilfe können die sauren Komponenten neutralisiert werden, oder allgemein formuliert, deren Ionisierungszustand und damit die Wechselwirkung mit der stationären Phase beeinflusst werden. Der Einsatz von Puffern ist grundsätzlich richtig und sinnvoll,…

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Muss es eigentlich immer HPLC sein?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung

Manche(r) fragt sich: „Was soll das für eine komische Frage und gar als HPLC-Tipp?“ Na ja, schauen wir mal. Der Fall Sie bestimmen den Gehalt eines Wirkstoffs, beispielsweise aus einer Tablette oder nach einer Freisetzung. Oder Ihre Aufgabe besteht darin zu überprüfen, ob der Kessel vor der nächsten Produktionscharge wirklich sauber ist (Reinigungsvalidierung). Wie auch immer, Sie erhalten einen einzigen Peak. Sie verwenden also eine kurze Säule, sagen wir 50 mm, das Chromatogramm dauert nicht lange, sagen wir 6 min. Wenn alles gut läuft und Sie sonst zufrieden sind, dann besteht in der Tat kein Handlungsbedarf. Sie brauchen nicht weiter…

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Miniaturisierung ja – aber was ist in der Routine wirklich machbar und sinnvoll?

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Peakverbreiterung, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Miniaturisierung ist aus wirtschaftlichen und analytischen Gründen häufig ein vernünftiger Ansatz. Was ist nun mit einem „normalen“ Gerät machbar und wann lohnt es sich? Die Lösung Vorbemerkung Für folgende Fälle kann ich die Skepsis mancher Kollegen gegenüber Miniaturisierung nachvollziehen und teilweise sogar teilen: Stark regulierte Umgebung, matrixbelastete Proben und/oder große Anzahl an Komponenten, keine HPLC-Spezialisten in Routine-/Betriebslabors, knappe Zeit, um auftretenden Fehlern nachzugehen, usw.. Das bedeutet keinesfalls, dass in solchen Fällen Miniaturisierung nicht sinnvoll ist, es heißt nur, dass vor einer „Ja/Nein“-Entscheidung eine nüchterne Analyse mit objektiven und belegbaren Vor-/Nachteilen unabdingbar ist, z. B: Was gewinne ich an…

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Ist die vorliegende Methode eine robuste Methode?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Robustheit

Der Fall Die Kollegen aus der Entwicklung schicken Ihnen eine Methode oder der Chef kommt triumphierend in das Labor mit der Kopie einer Methode in der Hand und sagt: „Machen Sie mal.“ Oder Sie bekommen den neuesten Prospekt der Firma Fanta­siechrom GmbH mit der Abbildung eines Chromatogramms samt Methode, die Sie gut gebrauchen können. Bevor Sie irgend etwas Chromatographisches anfangen, wür­de ich Ihnen dringend empfehlen, die Methode bei einer Tasse Kaffee/Tee etwas genauer anse­hen. Die Lösung Bei einigen Methoden weiß man/frau von Anfang an, dass sie kaum robust sein können. Wenn Sie dennoch die Methode übernehmen müssen, sollten Sie wenigstens…

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Übernahme einer Gradientenmethode – der Einfluss der Appa­ratur

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Ein klassischer Fall: Sie übernehmen eine Gradientenmethode und, obwohl Sie pein­lichst auf Einhaltung aller chromatographischen Bedingungen achten, erhalten Sie mit Ihrer Anlage ein anderes Chromatogramm. Warum? Die Lösung Fast immer liegt der Grund in den unterschiedlichen Verweilvolumina (Verzögerungs­volumina, Delay Volume oder Dwell Volume) einmal Ihrer Anlage und zum anderen der Anlage, mit der die Methode entwickelt wurde. Als Verweilvolumen wird das Volumen vom Ort der Mischung der zwei Eluenten (Mischventil, Mischkammer, T-Stück) bis zur Säule be­zeichnet. Dieses kann je nach Hersteller von ein paar hundert Mikrolitern bis zu mehreren ml betragen! Die Hochdruckgradienten haben im Vergleich zu den…

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Meine Peaks kommen zu früh – wie kann ich sie in einem RP-System nach hinten verschieben?

Von B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Angenommen, Ihre Peaks kommen in einem C18-ACN/H2O- oder MeOH/H2O-System viel zu früh, sagen wir irgendwo zwischen Totzeit und zweifacher Totzeit. Wenn Sie die Säule nicht überladen haben, dann liegt der Grund wohl darin, dass Ihre Substanzen sehr polar oder sogar ionisch sind. Wie können Sie nun die Retentionszeit erhöhen? Die Lösung Nachfolgend einige Möglichkeiten: Erster Fall: k-Werte (Retentionsfaktoren, relative Retention) sollen konstant bleiben; ,,Chemie“ bleibt konstant, d. h. die Wechselwirkungen mit der stationären Phase ändern sich nicht. Maßnahme: Säulenlänge erhöhen, Fluss erniedrigen Zweiter Fall: Änderung der k-Werte, d. h. es erfolgt ein Eingriff in die Wechselwirkung Substanz-stationäre Phase:…

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Entwicklung einer RP-Trennung – die „2 –Tage-Methode“ Teil 2: Feinoptimierung

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung

Der Fall Sie haben nun, wie in diesem Tipp geschildert, die „optimale“ Säule ausgesucht, jetzt haben Sie knapp einen Tag Zeit für die Feinoptimierung. Wie geht´s weiter? Die Lösung Nehmen wir an, Sie haben viele Peaks, also werden Sie wahrscheinlich mit dem Gradienten weiter experimentieren. 1. Ziel: „Vernünftige“ Analysendauer + grob „gute“ Trennung Die Möglichkeiten: Gradientenvolumen erhöhen/erniedrigen – am besten über den Fluss, siehe z. B. diesen Tipp Anfangs- und Endbedingungen variieren Evtl. Steilheit, Gradientenprofil ändern beziehungsweise eine isokratische Stufe einbauen. Zeitbedarf: ca. 2 Stunden 2. Ziel: Selektivität verbessern Die Möglichkeiten: pH-Wert um +/- 0,5 pH-Einheiten variieren Modifier wie z.B….

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