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A FehlersucheHPLC-Tipps

Geisterpeaks beim Blindgradienten

Der Fall Es ist Usus vor einem Gradienten-Lauf einen „Blindgradienten“ zu fahren. Sollte nun bei diesem Testlauf die Drift auffallend stark sein oder gar Geisterpeaks erscheinen, besteht Handlungsbedarf, denn: Wir haben hier wahrscheinlich mit Kontaminationen zu tun. Wie könnte man jetzt den Herkunftsort der Kontamination ausfindig machen? Die Lösung Man verlängere die Equilibrierzeit vor der nächsten Injektion. Wird ein vorher festgestellter Geisterpeak größer oder nimmt die Drift zu, so liegt das Problem in der wässrigen/wasserreichen Phase. Knüpfen Sie sich die Reinheit des Wassers und eventuellen Zusätzen vor: Wasser mit UV-Licht bestrahlen falls Algen im Spiel sind, Patrone(n) aus der Milli-Q-Anlage...
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9. November 2002
B OptimierungGradientHPLC-TippsInjektionsvolumenOptimierungPeakverbreiterungProbenlösungsmittelVeränderung der Retentionszeit

Schnelle Optimierung einer bestehenden Gradientenmethode

Der Fall Ich war einmal in einem befreundeten Unternehmen, in dem routinemäßig viele Gradientenmethoden laufen. Nicht alle waren aus Anwendersicht als zufriedenstellend zu bezeichnen. Wir wollten nun schauen, ob eine der häufig eingesetzten Methoden mit einem vertretbaren Aufwand verbessert werden könne, zumal die Anzahl der Proben sehr groß war. Der Versuch war erfolgreich. Ich möchte Ihnen nachfolgend zeigen, wie wir es bewerkstelligt haben, vielleicht können Sie davon profitieren. Die Lösung Abb. 1 stellt die Ausgangssituation dar: „Üblicher“ Methanol/Wasser-Gradient bei 1 ml/min, das Chromatogramm dauerte ohne Spülschritt ca. 16 min. Das war uns für zwei Peaks viel zu lang. Wir haben...
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8. Oktober 2002
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tippspolare KomponentenUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Ionenpaarreagenzien Trennung von starken Basen Früh eluierende Peaks und Peakform Drift beim Gradienten Überprüfung der Peakhomogenität 100 % Wasser In Wasser instabile Komponenten   Als beliebte Ionenpaarreagenzien gelten verdienterweise Hexan- und Heptansulfonsäure. Sollte jedoch irgend eine Ihrer Basen Ihnen zu früh kommen, denken Sie vielleicht alternativ auch an Campfersulfonsäure: Ihr Peak kommt später und Sie könnten evtl. besser trennen. Möchten Sie recht starke Basen wie β-Blocker oder organische Basen wie Tricyclische Antidepressiva trennen, aber Sie haben nur alte, „normale“ Säulen im Schrank? Nehmen Sie Ihre „0815“ Säule und verwenden als Eluent wie folgt: 100-200 mMol Natriumdodecylsulfat mit ca. 15% 1-Propanol...
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9. September 2002
A FehlersucheGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Säulenlagerung Geisterpeaks Saurer pH-Wert Änderung der Probelösung   Polare RP-Phasen, ob nicht-endcappte C18 oder polare „embedded phases“ oder welche mit kurzen Alkylketten usw. sollten Sie für längere Zeit, z. B. mehrere Monate, lieber in Mischungen des aprotischen Acetonitrils (ca. 70-80% ACN) und nicht des recht polaren Methanols lagern. Es besteht nämlich bei letzterem die Gefahr von Hydrolyse-Vorgängen, die Phasenoberfläche kann sich chemisch verändern Geisterpeaks zum Ersten: Sagen wir, Sie bekommen ungebetene, zusätzliche Peaks in Ihrem Chromatogramm, oder der Peak einer Komponente bekommt einen „Buckel“ usw. Sicherlich gibt es mehrere mögliche Ursachen dafür. Denken Sie bei Ihren Recherchen auch an die...
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9. August 2002
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseGradientHPLC-TippspH-Wert des EluentenSpülen, Reinigen & EquilibrierenUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Degasser Ultraschallbad pH-Wert-Verschiebung „sehr“ sauberes Wasser… Spülen Polymere durch das ACN Isokratische vs. Gradiententrennungen   Verfügen Sie nicht über einen Degasser und ist Ihnen Helium zu teuer, verwenden Sie einfach (sauberen!) Stickstoff. Er ist billig und leistet tolle Entgasungs-Dienste. Ein kleines Problemchen kann allerdings dabei auftauchen: Manche Pumpe „verschluckt“ sich etwas häufiger Ein Ultraschallbad ist bekanntlich als Entgasungs-Tool alleine recht uneffektiv. Es hat sich jedoch gezeigt, dass bei gepufferten Eluenten eine etwa 5-min Entgasung nach einer Vakuum-Filtration zu einer besseren Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten führt. Offensichtlich wird durch diese Prozedur eine gleichbleibende CO2-Konzentration und damit ein konstanter pH-Wert des Eluenten erreicht....
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9. Juli 2002
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tipps

Muss es immer Kaliumphosphat sein?

Der Fall Ein beliebter Puffer in der Routine-RP-Chromatographie ist zweifelsohne Kaliumphosphat: Kaliumdihydrogen- für den sauren, Dikaliumhydrogenphosphat für den neutralen/schwach-alkalischen Bereich. Eine Klarstellung vorweg: Wenn Sie mit „Ihrem“ Kaliumphosphatpuffer zufrieden sind, so ändern Sie um Gottes Willen nichts, verfahren Sie weiterhin wie gehabt und schauen Sie sich andere HPLC-Tipps an. Sollten Sie jedoch nicht ganz glücklich sein, so denken Sie vielleicht (sofern Sie etwas ändern dürfen… ) an Ammoniumphosphat, es hat gegenüber Kaliumphosphat einige Vorteile. Welche sind das? Die Lösung Ammoniumphosphat ist in höherer Reinheit erhältlich, dadurch treten bei empfindlichen Gradiententrennungen seltener Störpeaks auf Ammoniumphosphat ist besser löslich, dadurch besteht bei...
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5. Juni 2002
B OptimierungEluentHPLC-Tipps

Überprüfung der Peakhomogenität – die etwas aufwendigeren Maßnahmen

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über schnelle Möglichkeiten zur Überprüfung der Peakhomogenität nach einer erfolgten Trennung unterhalten. Dabei blieb des chromatographische System mehr oder weniger unverändert. Heute geht es um etwas aufwendigere Maßnahmen. Die Lösung 1. Änderung des Eluenten Zweifelsohne ist eine pH-Wert-Änderung die effektivste Möglichkeit, die Selektivität von ionischen oder auch von lediglich polaren Analyten zu verändern. Vorschlag: ± 0,5 oder ± 1 pH-Einheit bei sonst konstanten Bedingungen. Als zweite, relativ einfache Möglichkeit wäre folgende zu nennen: Belassen Sie es bei dem ursprünglichen pH-Wert, stellen jedoch jenen mit einer anderen Säure/Base ein, z. B. statt mit...
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9. Mai 2002
B OptimierungHPLC-TippsOptimierung

Schnelle Überprüfung der Peakhomogenität, Teil 1

Der Fall Sie sind an´s Ende einer Trennungsoptimierung angelangt, Ihre Peaks sehen recht anständig aus. Sie stehen nun vor der Frage: „Wie kann ich schnell die Peakhomogenität überprüfen?“ „Schnell“ bedeutet ohne großartige Hardware-Änderung (z. B. Säulenschaltventil einbauen) oder Änderung an der „Chemie“ (z. B. anderer Puffer). Im hiesigen Tipp sowie teilweise in diesem Tipp werden wir uns mit solch einfachen Maßnahmen beschäftigen, deren Realisierung höchstens ein Paar Minuten bis eine viertel Stunde dauert. In diesem Tipp werden wir uns etwas aufwendigere Maßnahmen anschauen. Die Lösung 1. Änderung von Einstellungen Durch Änderung von Einstellungen an der Apparatur wird natürlich nicht die...
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9. April 2002
A FehlersucheACNHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Reicht das Spülen der Säule mit Wasser bzw. mit Acetonitril aus?

Der Fall Sie merken es am erhöhten Druck, an plötzlich auftretenden Geisterpeaks, an einer Peakverbreiterung: Sie haben es einfach mit „Dreck“ zu tun, es muss gespült werden. „Spülen in der HPLC“ ist offensichtlich ein stets aktuelles Thema. Jedenfalls wird in HPLC-Veranstaltungen immer wieder die Notwendigkeit und die Effektivität einzelner Spülschritte diskutiert. Eine häufige Frage bei HPLC-Kursen lautet: „Reicht es, wenn ich meinen Puffer und sonstige polare Verunreinigungen mit Wasser und meinen organischen „Dreck“ mit Acetonitril „herunter“ spüle?“ Die Lösung In aller Regel, ja. Wenn man allerdings mit hartnäckigen Verunreinigungen zu tun hat, kann es in der Tat sein, dass die...
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10. März 2002
B OptimierungHPLC-TippsOptimierungpolare KomponentenSäulenauswahlStationäre Phase

Wann wird eine „polare“ C18-Phase benötigt?

Der Fall Auf dem Markt gibt es eine Reihe von hydrophoben, gut endcappeden, Metallionen-armen C18- und C8-Phasen eingeführt. Der Vorteil dieser Phasen liegt im Wesentlichen in der guten Chargenreproduzierbarkeit sowie in der hervorragenden Symmetrie für basische Analyten. Darüber hinaus wird eine gute Selektivität für organische Moleküle beobachtet – auch für welche mit polaren Gruppierungen. Sollte nun vor dem Hintergrund dieser handfesten Vorteile eine derartige Phase die erste Wahl bei der Entwicklung einer neuen Methode sein? Die Lösung Nicht unbedingt. Denn für die Trennung bestimmter Analyttypen sind polare Wechselwirkungen notwendig – und zu solchen sind Phasen mit einer ausgesprochen hydrophoben, gut...
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5. Februar 2002
ApparaturAuflösungB OptimierungBodenzahlHPLC-TippsTotvolumen

Erhöhung der Effizienz – häufig der schnellere Weg zum Erfolg

Der Fall Halten wir gleich zu Beginn fest: Der wichtigste, sicherste doch häufig auch aufwendigste Weg zur Verbesserung der chromatographischen Auflösung ( Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis ) ist die Erhöhung der Selektivität. Folgendes Zahlenbeispiel soll dies verdeutlichen: Bei einem Trennfaktor von 1,01 werden 160.000 theoretische Böden benötigt, um zwei Peaks Basislinie-getrennt zu eluieren. Bei einer Verbesserung des Trennfaktors (mit Hilfe vom pH-Wert, Modifier usw.) auf „nur“ 1,05 werden lediglich 6.000 Böden benötigt, bei einer Verbesserung auf 1,10 1.940 Böden und bei einem Trennfaktor von 1,20 gerade 575 Böden. Nochmal: Auch die winzige Verbesserung des Selektivitätsfaktors an der...
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8. November 2001
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLösungsmittelSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Spül – und „Waschflüssigkeiten“ für eine HPLC-Anlage

Der Fall Bei Bedarf (z. B. Geisterpeaks, Druckerhöhung usw.) sind Teile der Apparatur oder die Apparatur insgesamt zu spülen. Für jeden Zweck bzw. Modul haben sich bestimmte Lösungsmittel/Waschflüssigkeiten gut bewährt. Welche sind das? Wir lassen im Moment die Säule außer Acht, siehe dazu diesen HPLC-Tipp. Die Lösung In der nachfolgenden Tabelle sind einige dieser bewährten Spüllösungen aufgeführt. Abschlussbemerkungen: Unabhängig davon, womit Sie die Anlage gespült haben, sollte bei dem letzten Spülschritt vor dem Verlassen der Anlage für mehr als 2-3 Tage mindestens 40-50 % organisches Lösungsmittel (z. B. Acetonitril) enthalten sein, damit keine Mikroorganismen wachsen können. „Viel hilft viel“- diese...
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10. Oktober 2001
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tipps

Cut-off von Puffern

Der Fall In der Spurenanalytik stört naturgemäß eine starke UV-Absorption des Eluenten – vor allem im unteren Wellelängenbereich. Es versteht sich von selbst, dass wenn irgendwie möglich Acetonitril und nicht Methanol verwendet werden sollte und dass „Gradient“-Qualität für die Lösungsmittel hier eine Selbststverständlichkeit sein sollte. Nun, ist es leider so, dass praktisch jede Zugabe zum Eluenten ( Modifier, Puffer, Ionenpaarreagenzien usw. ) dessen Eigen-UV-Absorption erhöht. So kann beispielsweise nach der Zugabe von 1% Acetat zum Acetonitril praktisch ab 250 nm aufwärts empfindlich gemessen werden. Wie sieht es nun mit dem cut-off (Wellenlänge unter der man nicht messen kann, da die...
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5. September 2001
B OptimierungHPLC-Tipps

Trennung von basischen und sauren Komponenten in einer Probe

Der Fall Es gibt heute eine Reihe moderner Säulen, die sich hervorragend für die Trennung stark basischer Analyten eignen. Die Trennung starker Säuren dagegen gelingt in der Regel an nicht entcappeden „Klassikern“ gut. Etwas vereinfacht können wir wie folgt festhalten: Man nehme für starke Basen (d.h. dissoziiert vorliegend) : Silanol-arme RP-Phasen mit gut abgedeckter Oberfläche plus alkalischer Eluent, s. jedoch auch diesen Tipp Man nehme für schwächere organische Basen mit ausgeprägtem organischen Charakter (undissoziiert vorliegend): Phasen wie unter „1“ plus saurer Eluent Man nehme für schwächere Säuren (undissoziiert vorliegend): Phasen plus Eluent wie unter „2“ Man nehme für stärkere Säuren...
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8. August 2001
A FehlersucheFlussHPLC-TippsPeakverbreiterungpH-Wert des EluentenVeränderung der PeakflächeVeränderung des Chromatogramms

Änderung nur der Peakhöhe bzw. nur der Peakfläche – die Ursachen

Der Fall Für den Fall, dass auf ein Mal sowohl die Peakhöhe als auch die Peakfläche sich ändern gibt es eine Reihe von Ursachen, die jeder(m) erfahrenen Kollegin(en) sicherlich geläufig sind: verändertes Injektionsvolumen, instabile Probe, Leckage nach dem Injektor, evtl. Änderung vom pH-Wert (siehe diesen HPLC-Tipp), irreversible Sorption an „hungrigen Oberflächen“ (siehe diesen HPLC-Tipp), Änderung der Wellenlänge. Was bedeutet es aber, wenn nur die Peakhöhe bei konstanter Peakfläche bzw. die Peakfläche bei konstanter Peakhöhe sich ändert? Setzen wir voraus, dass Sie bewusst keine Hardware-Änderung vorgenommen haben, z. B. eine längere Säule oder eine Säule mit kleineren Teilchen eingesetzt. Vorbemerkung: Hier...
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10. Juli 2001
A FehlersucheHPLC-TippsLebensdauer der SäulepH-Wert des EluentenVeränderung der Retentionszeit

Fehlerquellen bei der Anwendung von Puffern

Der Fall Bei der Trennung von ionischen Analyten in der Routine sind gepufferte Eluenten unerlässig. Die Reproduzierbarkeit ist durch ihren Einsatz generell besser. Dennoch gibt es immer wieder Probleme: Mangelnde Stabilität von Retentionszeiten, Änderung der Peakform, geringe Lebensdauer der Säule. Was sind die Ursachen dafür? Die Lösung Denken Sie bitte an folgende Fehlerquellen: Falscher Puffer zu eingestelltem pH-Wert: Z. B. Phosphatpuffer bei pH=5. Zu schwacher Puffer: Z. B. Trennung von starken Basen und Verwendung eines 5 oder 10 mMol-Puffers – 20 mMol wäre „sichererer“. Messung in einem Bereich von +/- 1 pH-Einheit von pKs- Wert der Komponente. Z. B.Trennung von...
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5. Juni 2001
A FehlersucheHPLC-TippspH-Wert des EluentenVeränderung der PeakflächeVeränderung der Retentionszeit

Ein Peak verhält sich „komisch“ – was kann die Ursache sein?

Der Fall Fast alle Peaks bei einer Wiederholmessung verhalten sich recht „anständig“, d.h. Retentionszeit, Fläche, Peakform etc. bleiben konstant. Nur ein einziger Peak (oder vielleicht zwei) bereitet Ihnen Kopfschmerzen: Beispielsweise ist er permanent auf Wanderschaft oder er zeigt nicht die Fläche, die er zeigen sollte. Woran kann es liegen? Die Lösung Nachfolgend nenne ich Ihnen einige Ursachen. Die Betonung liegt wirklich auf „einige“, denn besprochenes Problem ist tatsächlich eines der unangenehmsten im HPLC-Alltag. Ich bin sicher, dass erfahrene LeserInnen auf manch weitere Ursache hinweisen könnten. Veränderung der Retentionszeit „Wanderung“ ( nur eines oder weniger Peaks ) deutet auf einen multiplen...
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9. Mai 2001
B OptimierungFlussHPLC-TippsVeränderung des Chromatogramms

Optimierung über die Säulenparameter – was „bringt“ was?

Der Fall Nehmen wir an, Sie müssen mit einer ganz bestimmten stationären Phase eine isokratische Trennung durchführen. Sie sind an diesem Material gebunden, weil beispielsweise Ihr Rohstoff-Lieferant bereits damit seine Methode validiert hat. Die erste Injektion liefert leider Gottes eine recht „lausige“ Trennung, die zweite auch. Gerät und Sonstiges ist in Ordnung. Sie haben jetzt von Ihrem Chef das OK – nachdem ja die stationäre und auch die mobile Phase „tabu“ sind – nun doch an den physikalischen Säulendaten und an dem Fluss etwas experimentieren zu dürfen. Man könnte folgende Parameter ändern: Säulenlänge vergrößern sowie Fluss, Teilchengröße und Innendurchmesser verkleinern....
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4. März 2001
B OptimierungHPLC-TippsSäulenauswahlStationäre Phase

Sind polare RP-C18-Phasen für die Trennung polarer Analyten besser als apolare?

Der Fall In letzter Zeit sind recht viele polare RP-Phasen eingeführt worden. Diese gehören im wesentlichen zu zwei Hauptgruppen: Zum einen sind es hydrophil endcappte Phasen („AQ“,„AQUA“) bzw. Phasen mit einer polaren Gruppe wie Phenyl oder Phenyl-Hexyl und zum anderen welche mit einer polaren Gruppe an der Alkylkette („embedded phases“), einer zusätzlichen positiven Ladung oder mit mehreren Funktionalitäten (Mixed Mode Phasen). Der polare Charakter bei den Letzteren ergibt sich durch die meist kurze Alkylkette (C8, C12, C16) und selbstverständlich durch eine/mehrere polare(n) Gruppe(n), oft Carbamat, Amid oder Harnstoff. Bedeutet nun dies, liebe AnwenderInnen, dass solche Phasen die erste Wahl bei...
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5. Januar 2001
B OptimierungChromatogrammHPLC-Tippskleine PeaksNachweisgrenzeOptimierung

Erniedrigung der Nachweisgrenze durch Optimierung der Injektion

Der Fall Die Verbesserung der Peakform ist in der Spurenanalytik (Reinheit, Stabilitäts- und Toxizitäts-Untersuchungen, Reinigungsvalidierung, Umweltanalytik) wichtiger als sonstwo. Denn wenn ich bei konstant injizierter Menge – und damit gleicher Fläche – einen scharfen und damit höheren Peak erhalte, ist die Quantifizierung mit einem kleineren Fehler behaftet. Es existieren einige bewährte Maßnahmen, die zu schmalen Peaks führen, z. B. dünnere Säulen, kleinere Teilchen, Erniedrigung des Totvolumens der Apparatur, Optimierung der Detektion, Verbesserung der Kinetik (Temperatur, Modifier) usw. Heute werden wir uns mit ein paar einfachen Tricks beim Injizieren beschäftigen. Die Lösung Es gibt zwei Ansätze: 1.) Verdünnung der Substanzzone verhindern...
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14. November 2000