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HPLC Tipps des Jahres

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A FehlersucheACNEluentJahrestippspH-Wert des Eluenten

Puffer in der RP-HPLC – was sind die wichtigsten Ursachen für mangelnde Reproduzierbarkeit von Retentionszeit und Peakfläche?

Zusammenfassung
Verschiebung des pH-Wertes; kommt Puffer als „Übeltäter“ infrage, so wären folgende drei Ursachen zu nennen: Falsch gewählter Puffer für den gewünschten pH-Wert, geringe Puffer-Konzentration sowie keine gleiche Konzentration von Säure (Base) und korrespondierendem Salz. In den beiden letzten Fällen ergibt sich ein schwacher Puffer.
Die nächsten zwei Punkte stellen zwar keine Fehler im engeren Sinne dar, sie sind dennoch Ursachen für mangelnde Reproduzierbarkeit: Verschiebung des pH-Wertes nach Zugabe des organischen Lösungsmittels und Änderung der Pufferstärke während eines Gradientenlaufs.

Der Fall
Sie übernehmen eine RP-HPLC-Methode, z.B. aus der Literatur, vom Kunden, von den Kollegen aus der Methodenentwicklung. Sie sind sicher, dass Sie keinen Fehler beim Ansetzen der mobilen Phase machen. Dennoch gibt es immer wieder Probleme mit schwankenden Retentionszeiten und/oder Peakflächen. Sie messen den pH-Wert des frischen Eluenten, dann wieder nach ca. 2-3 Stunden und auch den pH-Wert des Eluats (das, was von der Säule herauskommt). Sie erhalten unterschiedliche Werte, also bleibt der pH-Wert nicht konstant. Ergo: Der verwendete Puffer macht keinen guten „Job“. Wann ist dies der Fall?

Die Lösung
Nachfolgend die wichtigsten Ursachen:
1. Der verwendete Puffer ist zu schwach: Je geringer die Konzentration, desto kleiner der pH-Wert-Bereich, in dem der Puffer für einen konstanten pH-Wert sorgen kann, siehe dazu Abbildung 1.

So reicht beispielsweise die Pufferkapazität eines 10 mM Acetat-Puffers aus, um einen pH-Wert-Bereich zwischen pH = 4,5-5,0 abzupuffern, ein 20 mM starker Puffer kann einen pH-Wert-Bereich zwischen pH = 3,8-5,8 und ein 40 mM starker Puffer schließlich einen pH-Wert-Bereich zwischen 3,5-6,0 abpuffern.
Ein weiterer Vorteil von konzentrierten Puffern ist die Verbesserung der Peakform, als Nachteil kann die verkürzte Lebensdauer der Säule sowie die bekannten Probleme mit der Pumpe genannt werden. Ein vernünftiger Kompromiss für kleine Moleküle sind oft 20 mM-Puffer, für Biomoleküle werden wesentlich konzentriertere Puffer benötigt.

  1. Nicht-passende Konzentration von vorliegendem Salz und zugegebener Base (Säure), um einen bestimmten pH-Wert einzustellen. Z. B. liegen 10 mM Natrium-Phosphat oder 10 mM NaOH vor und es wird eine stark-konzentrierte Phosphorsäure zur Einstellung des pH-Wertes verwendet. Die Menge an Salz (Base) ist zu gering, um die zugegebene Säure gänzlich „aufzufangen“, der resultierende Puffer ist demnach ebenfalls ein schwacher Puffer, der pH-Wert verschiebt sich.
  2. Der verwendete Puffer passt nicht zu dem gewählten pH-Wert. Beispielsweise ist Phosphatpuffer für einen avisierten pH-Wert von 4 oder 5 nicht geeignet, er hat in diesem Bereich kaum eine Puffer-Kapazität, siehe Abbildung 2.

Der Phosphatpuffer ist geeignet für folgende drei pH-Wert-Bereiche (ca. +/- eine pH-Einheit um den jeweiligen pKS-Wert):
ca. 1,3-3,1
ca. 6,2-8,2
ca. 11,4-13,4

Nun die zwei weiteren Punkte:

  1. Nach der Zugabe eines organischen Lösungsmittels ändert sich der pH-Wert – auch wenn ein richtiger Puffer in genügend starker Konzentration vorliegt, siehe Abbildung 3: Betrachten wir beispielsweise einen Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0. Nach der Zugabe von 60 % MeOH ergibt sich ein pH-Wert von ca. 8,5. Auch wenn bei einem derart hohen MeOH-Anteil kaum vom „pH-Wert“ gesprochen werden kann (man müsste mit korrigierten Werten arbeiten …), können wir festhalten, dass der pH-Wert des Eluenten definitiv ins Alkalische driftet – die Säule hält nicht lang. Umgekehrt, liegt ein Puffer bei einem pH-Wert von ca. 9,2 vor, ergibt sich nach der Zugabe von Methanol eine (leichte) Abnahme des pH-Wertes (auf ca. 8,5). Mit ACN verhält es sich analog, die Verschiebung des pH-Wertes fällt allerdings geringer aus.

  1. Wenn Sie sich wirklich einen linearen, „klassischen“ Gradienten wünschen und keinen ungewollt dreifach-Gradienten (Lösungsmittelstärke, Salz, pH-Wert) fahren wollen und ferner eine quaternäre Pumpe zur Verfügung haben, könnten Sie folgenden Trick anwenden:
    Kanal A: Wasser
    Kanal B: ACN
    Kanal C: Puffer, er wird mit 10 % der Gesamtflussrate gefördert, Pufferkonzentration: 10-mal die Endkonzentration im Eluenten, der Gradient wird wie gewohnt gemischt. 

Das Fazit
Einer unbeabsichtigten Verschiebung des pH-Wertes kann durch
– den richtigen Puffer (abhängig vom gewünschten pH-Wert-Bereich)
– einen genügend stark konzentrierten Puffer
– sowie einen Puffer, eingestellt mit gleicher Molarität an korrespondierendem Salz
(Base) und Säure
begegnet werden.

Ferner sollte an die Verschiebung des pH-Wertes beim Gradienten durch die stete Zunahme des organischen Anteils im Eluenten sowie an eine evtl. gleichzeitige Änderung der Pufferkonzentration gedacht werden. Die Konsequenzen bei einer unbeabsichtigten Verschiebung des pH-Wertes können vielfältig sein: Verschiebung der Retentionszeit, Veränderung der Peakform, Veränderung der Peakfläche. Und eine solche Verschiebung/Veränderung kann je nach Struktur der Analyten von marginal bis gravierend ausfallen. Auch eine Änderung der Elutionsreihenfolge kommt nicht selten vor.

sk
1. November 2025
AllgemeinEinstellparameterJahrestippsNachweisgrenze

Die kleine Frage zur Validierung …

„Wir haben bei der Bestimmung vom LOQ starke Schwankungen. Auch an unterschiedlichen Geräten und mit neuen Säulen. Woran kann das liegen? Als LOQ-Kriterium haben wir wie üblich ein S/N-Verhältnis von 10:1.“

Antwort:
Die Erfahrung zeigt, dass hier mit recht großen Integrationsfehlern zu rechnen ist.
Wir konnten zeigen (s. Infos am Ende des Beitrages), dass kaum eine kommerzielle Software in der Lage ist, bei automatischer Integration und einem S/N-Verhältnis von 10:1 so zu integrieren, dass der Fehler – bei optimalen (!) Bedingungen (BL-Trennung, kaum Drift usw.) – nicht mindestens 5-10 % beträgt. Siehe dazu weiter unten die Werte in der Tabelle für den ersten, kleinen Peak (oben): In den grau schraffierten Feldern befinden sich Werte mit einer Abweichung von mehr als 1 % vom richtigen Wert, bedingt durch eine fehlerhafte Integration.

 

Einige Kommentare und Erläuterungen zu den Werten der Tabelle:

  • Die verwendeten Einstellparameter („Settings“) wie Dwell-Time, Time Constant, Sample Rate usw. können – vor allem bei kleinen Peaks – die Integration beeinflussen. So ist beispielsweise die Abweichung vom richtigen Wert beim ersten Peak bei einem Threshold-Wert von 50 12,50 %, bei einem Threshold-Wert von 100 17,78 % (EZChrom)
  • Bei einigen Software-Programmen können unterschiedliche Integrationsalgorithmen angewandt werden. Die erhaltenen Ergebnisse können dabei recht stark abweichen, siehe z. B. die Werte der zwei Spalten bei Empower und Chromeleon (Waters, Dionex/Thermo). Das betrifft nicht nur absolute Abweichungen, es können sich sogar sowohl Unter- als auch Überbefunde ergeben
  • Erst ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 ist bei allen kommerziellen CDS (Chromatography-Data-Systems) der Integrationsfehler merklich kleiner 1 %

Fazit bzgl. Richtigkeit – wenn das Ziel zuverlässige Ergebnisse lautet:
– Bei symmetrischen, BL-getrennten Peaks liegt der Fehler durch die Integration erst
ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 gesichert unter 1 %
– Bei tailenden, Nicht-BL-getrennten Peaks – evtl. noch auf einer driftenden Basislinie –
ist ein S/N-Verhältnis von ca. 100:1 empfehlenswert.

Auch die Reproduzierbarkeit der Integration bei mehrfacher Injektion (Präzision) lässt bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 oft zu wünschen übrig.

Empfehlung bzgl. Reproduzierbarkeit von Ergebnissen am LOQ:
Injizieren Sie sechs Mal eine reale Probe und ermitteln bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 den Variationskoeffizienten (VK, RSD, Relative Standard Deviation). Frage: Genügt der resultierende VK bei diesen chromatographischen Bedingungen an dieser Apparatur und bei diesen Settings Ihren Anforderungen? Wenn nicht, wäre das S/N-Verhältnis so lange zu erhöhen, bis dies der Fall ist. Diese Konzentration kann dann als gesichert reproduzierbares LOQ (Limit Of Quantification, Bestimmungsgrenze) angesehen werden, die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wäre somit gegeben: Ihre Software kann bei dieser Konzentration reproduzierbar integrieren. Ein möglicher systematischer Fehler („Unrichtigkeit“ der Peakfläche und somit des Gehaltes) bleibt natürlich unerkannt, siehe dazu weiter oben „Richtigkeit“.
Merke:
Das in einigen regulierten Bereichen (FDA, ICH etc.) etablierte S/N-Verhältnis von 10:1 als Kriterium für LOQ basiert auf Richtlinien, es sind keine unverrückbare/gesetzliche Vorgaben: Es handelt sich ja um „Guidelines“ und nicht um „Regulation“/“Legal Requirements“. Es zeigt sich, dass mit Begründung ein größeres S/N-Verhältnis als Kriterium für LOQ von Auditoren/Inspektoren durchaus akzeptiert wird.

sk
1. September 2025
AllgemeinJahrestippsNachweisgrenze

Die kleine Frage zur Validierung …

„Validierung ist aufwendig und teuer; was ist das Minimum an Validierung, was wir machen müssen?“

Zwei Vorbemerkungen
Vor einer Antwort halten wir wie folgt fest:
1. Es gibt viele Definitionen zur Validierung, eine davon lautet: „Das Ziel bei der Validierung einer analytischen Methode ist zu zeigen, dass sie für den beabsichtigten Zweck geeignet ist.“
2. Validierung ist – anders als z. B. GLP – kein Gesetz. Es gibt demnach de jure keine offizielle Stelle, die bzgl. Umfangs, Validierungstiefe, Durchführung, Revalidierungbedarfs etc. gesetzlich bindende Vorgaben macht.

Somit jetzt schon einige Schlussfolgerungen:

  • Validierung ist demnach etwas recht Individuelles: Um was geht es in einem aktuellen Fall eigentlich? Muss ich eher formale Sachen beachten, muss also eine wichtige Person/Organisation lediglich „nicken“? Oder stehen analytische Gesichtspunkte im Vordergrund, die notwendiger-/sinnvollerweise zu beachten sind?
  • Sehr wohl ergibt sich häufig de facto aus bestimmten Zwängen/Gegebenheiten genau „was“, „wie“, und „wieviel“ an Validierung zu tun ist. Wenn ich diese Vorgaben missachte, bekomme ich beispielsweise keine Zulassung für mein Produkt bzw. kann ich besagte Methode gar nicht anwenden. Wenn ich solchen Zwängen nicht unterliege, kann ich selbst denken und dem „beabsichtigten Zweck“ gemäß handeln.
  • Das heißt, ich suche aus der „Validierungsklaviatur“ (Richtigkeit, Präzision, Linearität, Robustheit etc.) diejenigen Validierungsparameter aus, die ich für den konkreten Fall – Eignung der Methode für den beabsichtigten Zweck – als entscheidend identifiziere. Diese werden dann in dem Umfang und in der Validierungstiefe, die ich als dienlich erachte, geprüft.

Drei Beispiele zu der Frage, wer über Umfang und Durchführungsmodus letzten Endes bestimmt:

  • Ich bin dabei, eine Methode für einen Kunden zu validieren, der lediglich von mir hören möchte, dass die von mir entwickelte Methode „validiert“ ist – mehr interessiert ihn nicht. Hier habe ich zu denken, was zu tun ist, um – mit möglichst geringem Aufwand – Gefahr für den Kunden abzuwenden
  • Der (hoffentlich) fachkundige Mitarbeiter einer Nationalbehörde sagt mir, was er erwartet – das habe ich sinnvollerweise genau zu befolgen
  • Ich arbeite in einem stark regulierten Bereich, z. B Pharma; wenn ich gemäß den ICH-Richtlinien (bei Beachtung der Spielräume!) validiere, werde ich bzgl. Validierung definitiv kaum Probleme bekommen

Nachfolgend vier Beispiele, die aus analytischer Sicht sowohl einen individuell notwendigen Umfang als auch eine notwendige Validierungstiefe bedingen:

  • HPLC-Methode für einen Textilfarbstoff
  • HPLC-MS/MS-Methode für einen hochtoxischen Metaboliten in Human-Serum
  • Quantitative Erfassung mittels GC-MS aller vorhandenen Pestizide einer Mülldeponie-Probe
  • Gehaltsbestimmung eines Wirkstoffs in einer klaren Lösung mittels HPLC-UV

Es handelt sich hier um vier völlig unterschiedliche Situationen:

Zu 1: Es ist ziemlich unwichtig, ob mein Pulli etwas mehr oder etwas weniger
rot ist …
Zu 2: Hier ist höchste Sorgfalt gefragt, es geht schließlich um Menschenleben
Zu 3: Sehr, sehr aufwendig und vermutlich langwieriger Validierungsaufwand
Zu 4: Wahrscheinlich einfach und zügig durchzuführen

Antwort:
Nachfolgend drei Beispiele für eine „Mini-Validierung“, die völlig in Ordnung wäre:

  • Sogenannte „Ergebnisvalidierung“; ich beweise, dass für diese Konzentration in dieser Matrix die geforderte/erwartete Präzision und Richtigkeit gegeben ist – fertig
  • Ein neuer Lieferant bietet mir einen bestimmten Rohstoff sehr günstig an; es reicht, wenn ich sehr (!) gründlich die Selektivität bestimme: Ist die von mir spezifizierte Reinheit gegeben? Fertig.
  • Ich möchte, dass mein Geschäftspartner (Lohnhersteller, outgesourcte Qualitätskontrolle usw.) zuverlässige/validierte Ergebnisse erzeugt. Ich schicke ihm die Methode mit definierten Anforderungen und schaue, ob er die geforderten Ergebnisse/Anforderungen gemäß einer praktikablen, statistischen Relevanz erzielen kann. Tut er das? Das reicht.

Abschließendes Fazit, wobei der erste Punkt der wichtigste ist:
– „Verstehe“ was das eigentliche Ziel der Validierung in diesem Fall ist
– Entscheide demnach über Umfang und Details zur Durchführung
– Dokumentiere gründlich alles Relevante

Durch diese systematische Handlungsweise wirst du wahrscheinlich keinen groben Fehler bzgl. Validierung machen. Du wirst jedenfalls mindestens eine solide Basis geschaffen haben; evtl. notwendige Ergänzungen und Anpassungen dürften später leicht umzusetzen sein.

sk
7. August 2025
B OptimierungChromatogrammDetektorJahrestippsLC-MS-KopplungOptimierung

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Das Nonplusultra zur Überprüfung der Peakhomogenität: Multidetektion und 2D-Chromatographie

Zusammenfassung

Multidetektion und insbesondere 2D-Chromatographie sind die besten Tools, um Peakhomogenitäten zu überprüfen bzw. mittels letzterer die Auflösung zu verbessern. Der Aufwand jedoch bei der Etablierung einer 2D-HPLC sollte nicht unterschätzt werden. Ferner sind zwei Nachteile bei 2D-Anwendungen zu nennen: Mangelnde Robustheit und Verlust an Empfindlichkeit.

Der Fall

Beim letzten HPLC-Tipp haben wir uns den orthogonalen Test angeschaut: Eine gänzlich andere Säule und/oder ein gänzlich anderer Eluent sind sehr hilfreich, um die Peakhomogenität (Peakreinheit) zu überprüfen. Heute geht es um die in diesem Zusammenhang vermutlich zwei besten Tools:
Stufe 1, recht einfach: Einsatz eines zweiten/dritten Detektors; Multidetektion ist mittlerweile in vielen Laboren eine Selbstverständlichkeit
Stufe 2, recht aufwendig: „2D“ (2-dimensionale Chromatographie) anwenden; 3D gibt es zwar auch schon seit jeher – aber lassen wir es hier lieber …
Was hat denn beides auf sich?

Die Lösung

  1. Multidetektion

Ein zweiter/dritter Detektor in Serie kann erstens Peaks detektieren, die bei Verwendung nur eines Detektors unsichtbar bleiben und zweitens Peaks, die schlecht abgetrennt sind, wenigstens als solche erkennen.
In Abb. 1 wird die Verunreinigung bei 6,72 min nur mit MS (ESI-Positiv), jedoch nicht mit DAD erkannt (oberes Bild). Im ESI-Negativ-Modus (unteres Bild) ist zwar das Signal bei 6,72 min wesentlich größer, dafür fehlt jedoch der Peak bei 2,33 min.

Abbildung 1
Durch zwei Detektoren in Serie können mehr Peaks erkannt werden, Details, siehe Text

Fazit 1: DAD-MS/MS mit allen seinen Facetten (mehrere Spektren, zwei Interfaces, zwei Übergänge etc.) ist ein sehr guter Ansatz und seit längerem Stand der Technik

Allerdings: Nicht alle Komponenten sind UV-aktiv und nicht Alle können ionisiert werden. Ein Universal-Detektor wie CAD, der „alles“ sieht oder ein spezifischer und empfindlicher Detektor wie FLD stellen hier sehr gute Ergänzungen dar.
In Abb. 2 wird ein Chromatogramm mit CAD, DAD und MS gezeigt. Mit CAD werden zunächst „alle“ Peaks angezeigt. Die Verunreinigung bei ca. 1,7 min allerdings wird beim UV-Detektor kaum, beim universalen aber unempfindlichen Aerosoldetektor CAD nicht erkannt. Dies ist nur mithilfe der MS-Kopplung der Fall (mittleres Chromatogramm).

Abbildung 2
Die Verwendung mehrerer Detektoren erweitert die Detektierbarkeit chemisch unterschiedlicher Komponenten, Details, siehe Text

Fazit 2: Neben der Kopplung DAD-MS/MS wäre je nach Fragestellung ein weiterer, Universal- oder ein spezifischer/empfindlicher Detektor eine gute Ergänzung, auch dies ist bereits Stand der Technik  

  1. 2D-Chromatographie

Das 2D-Prinzip, stark vereinfacht: Nach der Trennung an einer Säule (erste Dimension, Trennmechanismus A) wird/werden ein Peak/alle Peaks zu einer zweiten möglichst orthogonalen Säule (zweite Dimension, Trennmechanismus B) überführt und dort weiter aufgetrennt.
Die häufigsten Kombinationen sind: HILIC-RP, RP-RP, SEC-IEX, LC-SFC.
Die anschließend üblichen Detektionsmodi sind: MS/MS, IM-MS, ICP-MS.
2D ist nicht neu; Abb. 3 zeigt die 2D-Trennung von Chlorphenolen aus den 1990er Jahren, die zwei orthogonalen Säulen waren Kieselgel und C18.

Abbildung 3
Koeluierende Komponenten unter einem Peak können mittels zweier unterschiedlicher Säulen im 2D-Modus aufgetrennt werden

Abb. 4 zeigt eine 2D-Trennung aus den 1980er Jahren, die Kopplung hier war HPLC-DC (Dünnschicht-Chromatographie): Unter dem letzten HPLC-Peak „D“ befinden sich 18 (!) Komponenten, die mittels DC erkannt werden. Je unterschiedlicher die Trenn-Mechanismen sind, umso größer ist die Anzahl der theoretisch trennbaren Komponenten (Multiplikation der Peakkapazitäten der zwei Trennmodi).

 

Abbildung 4
Unter einem HPLC-Peak können sich mehrere Komponenten verbergen, Details, siehe Text

Natürlich werden viele Leser:innen jetzt denken, „So schlimme Chromatogramme haben wir bei uns erfreulicherweise nicht“, siehe jedoch dazu Abb. 5: Chromatogramm mit zunächst „nur“ 6 Peaks: Man erkennt zwar leicht durch den „Buckel“ beim vierten Peak, dass dieser nicht homogen ist (zwei Peaks, siehe LC x LC-Kopplung, rechts im Bild). Der dritte, völlig symmetrische Peak allerdings enthält drei Komponenten!
Merke: Peaksymmetrie ist verführerisch.

 

Abbildung 5
2D-Chromatographie erhöht stark die Wahrscheinlichkeit, Koelution auch im Falle von symmetrischen Peaks zu erkennen, Details, siehe Text

Fazit 3: 2D mit anschließender Multidetektion ist vermutlich die beste Möglichkeit, die Peakreinheit zu überprüfen, bzw. die Auflösung zu verbessern

Bemerkungen:

  • Seit Jahren bieten alle großen HPLC-Anbieter ausgereifte Hardware-Lösungen für 2D-Trennungen, deren Knowhow sollte gezielt genutzt werden
  • 2D kann nicht von „jetzt auf gleich“ etabliert werden, praktische Herausforderungen (z. B. „Mismatch“ Eluent 2. Dimension u.v.m.) sind nicht vernachlässigbar. Für 2D-Projekte sollten erfahrene Mitarbeiter:innen abgestellt werden, alternativ könnte an die Vergabe einer Bachelor-/Master-Arbeit gedacht werden. Arbeitskreise, die hier fundierte Erfahrungen haben sind: Prof. Michael Lämmerhofer, Tübingen, Prof. Oliver Schmitz, Duisburg-Essen
  • 2D ist hervorragend geeignet, um die Peakreinheit zu überprüfen bzw. die Auflösung zu verbessern. Folgendes sollte allerdings hier nicht vergessen werden: Mit Robustheit wird es „schwierig“ und die Empfindlichkeit nimmt ab.

Weitere Infos zum Thema:

© Dr. Stavros Kromidas

Restliche HPLC-Tipps des Jahres unter: https://www.kromidas.de/hplc-tipps-des-jahres/

sk
14. Juli 2025
ACNAllgemeinChromatogrammEluentJahrestippsLösungsmittelOptimierungSäuleSäulenauswahlStationäre PhaseVeränderung des Chromatogramms

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Der orthogonale Test: Bester Test bzgl. Nutzen/Aufwand-Verhältnisses zur Prüfung der Peakhomogenität

Zusammenfassung:
Orthogonaler Text: Verwende eine „ganz“ andere Säule (z. B. statt einer C18 nun eine PFP oder eine Mixed Mode) und/oder einen anderen Eluenten (mobile Phase statt mit ACN nun mit MeOH) und injiziere erneut. Ähnliche Substanzen gehen wahrscheinlich (etwas) andere Wechselwirkungen mit der stationären Phase ein. Somit offenbart sich, dass ein symmetrischer Peak evtl. doch nicht homogen ist.

Der Fall
In den letzten zwei HPLC-Tipps haben wir folgendes gesehen: Eine Änderung von Einstellparametern („Settings“) sowie „Manipulationen“ der Probelösung stellen schnelle Möglichkeiten dar, die Peakhomogenität zu prüfen. Heute geht es um den orthogonalen Test. Was ist das und was „bringt“ er?

Die Lösung
Am Ende einer Methodenentwicklung kommt häufig die Frage auf: „Habe ich alle Peaks trennen können, oder liegt womöglich irgendwo im Chromatogramm doch eine Koelution vor“? Jetzt kommt der orthogonale Test ins Spiel – die Idee dahinter: Man verwende eine völlig andere stationäre Phase oder einen anderen Eluenten und injiziert erneut. Es ist ziemlich unwahrscheinlich, dass zwei oder drei Komponenten bei Verwendung zweier gänzlich (!) unterschiedlichen Säulen bzw. Eluenten in beiden Fällen völlig gleich starke Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen. Wenn nun mit einem Eluenten an zwei unterschiedlichen Säulen oder mit zwei unterschiedlichen Eluenten an einer Säule sich die gleiche Anzahl an Peaks ergibt, ist dies eine recht starke Indiz für Peakhomogenität.
Merke:
1. Wichtig ist eine echte Orthogonalität – nimm´ nicht lediglich eine andere C18-Säule!
2. Es geht bei diesem Test ausschließlich um die Anzahl der Peaks in beiden chromatographischen Systemen. Die Peakform ist in diesem Zusammenhang völlig unwichtig, ebenso wie eine eventuelle Verschlechterung der Auflösung irgendwo im Chromatogramm

Ich habe solche Tests mehrmals durchgeführt, nachfolgend einige Beispiele aus der Praxis:
In Abbildung 1 wird die Trennung von polaren und apolaren Komponenten an zwei Waters-Säulen gezeigt. Obwohl das CSH-Material (linkes Chromatogramm) eine zusätzliche schwach positive Ladung auf der Oberfläche aufweist und Cortecs (rechtes Chromatogramm) ein „Core Shell“-Material ist, sehen die zwei Chromatogramme recht ähnlich aus.

Abbildung 1
Obwohl beide C18-Säulen recht unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, liegt keine „echte“ Orthogonalität vor, Ergebnis: Ähnliche Chromatogramme, Details, siehe Text

Nur wenn ich den in der Probe vorhandenen polaren Molekülen zusätzliche Ionenaustausch-Wechselwirkungen (Abbildung 2, links, HSS SB ist eine nicht-endcappede Phase), bzw. sehr starke zusätzliche polare Wechselwirkungen anbiete (Abbildung 2, rechts, HSS-PFP ist eine Penta-Fluoro-Phenyl-Phase), kann ich sie trennen.

Abbildung 2
Gleiche Probe wie in Abbildung 1, hier jedoch zwei völlig unterschiedliche stationäre Phasen

Abbildung 3 rechts: Moderne, endcappede Phase, 3 Peaks. Der erste, schmale Peak suggeriert Peakhomogenität. Bei Verwendung einer fluorierten C7-Phase (Abbildung 3, Mitte) bzw. einer alten, kontaminierten, nicht-endcappeden Phase (Abbildung 3, links) sind 4 Peaks zu sehen.

Abbildung 4 links: (schwach) polare C18-Phase, Mitte: Klassische C18-Phase. In beiden Fällen eluiert bei 2,91 bzw. 2,78 min ein symmetrischer, schmaler Peak. Nur durch die Verwendung einer Mixed-Mode-Phase (zusätzliche komplex-fähige Gruppe auf der Oberfläche des Materials) offenbart sich ein weiterer Peak.

Ein letztes Beispiel eines orthogonalen Tests mit unterschiedlichen Säulen: In Abbildung 5, rechts, wird die Trennung von Metaboliten von Antidepressiva an einer Ascentis C18-Säule gezeigt. Durch den Einsatz einer Ascentis C16-Amid-Phase wird ersichtlich, dass der symmetrische Peak Nr. 2 bei knapp 10 min an der C18-Phase in Wirklichkeit zwei Komponenten enthält (Zwei Peaks bei 5 min an der C16-Amid-Phase).

Abbildung 5
Trennung von Metaboliten von Antidepressiva an einer C18- und an einer C-16-Säule, Details, siehe Text

Zum Schluss zwei Beispiele mit zwei unterschiedlichen organischen Lösungsmitteln:

Abbildung 6, Injektion einer Mischung von polaren Komponenten: In ACN (rechts) 3 Peaks, in MeOH (links) 5 Peaks.

Abbildung 7, rechts ACN: Direkt an der Totzeit Koelution zweier Basen; links MeOH, man erkennt hier immerhin drei Peaks.

Das Fazit
Ein orthogonaler Test (denk´ an eine echte Orthogonalität!) ist ein ausgesprochen gutes Tool zur Prüfung der Peakhomogenität mit einem vertretbaren Aufwand:
1. Schnell realisierbar: Über die Mittagspause die Probe einfach über eine ganz andere Säule laufen und anschließend sich überraschen lassen …
2. Wenn Peakhomogenität bei einer bestimmten Fragestellung ein wirklich wichtiges Thema ist, wäre nach meinem Dafürhalten folgender Aufwand ebenso vertretbarer: Über Nacht statt ACN, MeOH als organischem Lösungsmittel verwenden oder/und 10 % des ACN gegen THF ersetzen und über zwei völlig unterschiedliche Säulen die Probe laufen lassen. Vergleiche am nächsten Morgen lediglich Chromatogramme und Anzahl der Peaks.

 

© Dr. Stavros Kromidas

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sk
22. Mai 2025
AllgemeinB OptimierungInjektionsvolumenJahrestippsLösungsmittelpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)polare KomponentenProbenlösungsmittel

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Schnell durchzuführende Tests zur Prüfung der Peakhomogenität – im Focus heute: Die Probelösung (Diluent).

Der Fall

Wie beim vorherigen HPLC-Tipp geht es auch heute um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Beim letzten Mal haben wir gesehen, dass eine Änderung der Einstellparameter („Settings“) durchaus hilfreich sein kann. Heute steht die Probelösung im Focus: Schnell durchzuführende „Manipulationen“ bzgl. Probelösung können ebenso helfen. Welche wären das?

Die Lösung

  1. Verdünne die Probelösung oder injiziere weniger

Wir alle überladen öfters als gedacht die „arme“ Säule. Ergebnis: Verschlechterung der Auflösung. Eine lokale Überladung der Säule macht sich vor allem am Anfang des Chromatogramms bemerkbar; dort eluieren in einem RP-System polare Komponenten, die zusätzliche polare Wechselwirkungen mit der Oberfläche der stationären Phase eingehen können („Dualer Mechanismus“). Die Devise lautet: Probelösung, also Diluent, einfach mit Wasser verdünnen oder vielleicht noch einfacher: Weniger injizieren. In Abbildung 1, rechts, wird die Injektion von 20 µl Acetophenon gezeigt: Der erste Peak ist eine Verunreinigung, der zweite die Hauptkomponente Acetophenon. Anschließend wurde lediglich Eluent injiziert, linkes Chromatogramm. D.h. hier wurde der Memory-Effekt ausgenutzt: Es befindet sich häufig ein kleiner Rest der Probe an der Nadel, der nicht immer 100% weggespült wird. Wie man leicht erkennt, ist die Verunreinigung sauber, Acetophenon dagegen nicht: Auch mit 20 µl kann eine Säule lokal überladen sein.

Erfahrene Anwenderinnen kennen nun das und es wird grundsätzlich wenig injiziert, z. B. 5 µl, siehe Abbildung 2. Betrachten wir den Peak bei 3,557 min. Wenn anschließend lediglich 1 µl injiziert wird, erkennt man leicht (siehe rechts das gezoomte Chromatogramm), dass der Peak nicht homogen ist. Sogar 5 µl – natürlich auch abhängig von der Konzentration – können zu viel sein. Ein weiterer Beleg für die Überladung bei der Injektion von 5 µl im vorliegenden Fall ist die kürzere Retentionszeit (3,557 min vs. 4,154 min), denn: Eine Überladung geht meist mit einer Abnahme der Retentionszeit einher. Überladung bedeutet ja, dass bestimmte aktive Zentren an der Oberfläche der stationären Phase belegt sind, die Moleküle finden keinen Platz für eine Wechselwirkung, sie eluieren folglich früher.

 

 

  1. Die Probelösung soll schwächer (in einem RP-System, sprich: Polarer) als der Eluent bzw. der Anfangsgradient sein; verändere auch den pH-Wert der Probelösung!

Betrachten wir in Abbildung 3 den Peak bei ca. 2,203 min, oben links: Bei der Zugabe von einem Neutralsalz (hier KCl) zu der Probelösung wird eine Peak-Aufsplittung beobachtet (unten links). Statt einem Neutralsalz kann auch der für den Eluenten verwendete Puffer benutzt werden (oben rechts), es erscheint ein weiterer Peak. Schließlich kann der pH-Wert der Probelösung verändert werden (unten rechts). Bei Unkenntnis des pKA/B-Wertes der betreffenden Komponente, einfach in ein vial mit der Probe einen „Tropfen“ Säure und in ein zweites einen „Tropfen“ Base dazu tun und jeweils nochmal injizieren.

In Abbildung 4 wird ein weiterer Fall gezeigt, wo lediglich durch eine Veränderung des pH-Wertes der Probelösung eine Verbesserung der Auflösung erreicht wurde.

 

 

  1. Verändere das Probelösemittel

In Abbildung 5 wird ein Chromatogramm gezeigt, einmal mit ACN und einmal mit MeOH als organischem Lösemittel zum Auflösen der Probe. Bei Peak Nr. 1 und 3 spielt die Natur des organischen Lösemittels keine Rolle. Peak Nr. 2 entpuppt sich jedoch als zwei Komponenten, wenn ACN verwendet wird. Auch als schneller Test zur Prüfung auf Peakhomogenität „zwischendurch“ geeignet: Ein „Tropfen“ Iso-OH oder THF zu der Probelösung dazu geben und nochmal injizieren. Bleibt die Anzahl der Peaks gleich?

 

Das Fazit

Verdünnen/weniger injizieren sowie „Manipulationen“ – im positiven Sinne! – der Probelösung stellen schnelle Tests zur Prüfung der Peakhomogenität dar. Und: Die Probelösung verändern geht schneller als den Eluenten verändern.

© Dr. Stavros Kromidas

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sk
7. April 2025
AuflösungB OptimierungChromatogrammEinstellparameterJahrestippsLC-MS-KopplungNachweisgrenzeOptimierungpolare KomponentenVeränderung des Chromatogramms

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Einfache Tests zur Prüfung der Peakhomogenität

Der Fall

Im HPLC-Tipp vom letzten Dezember war Peaky am Zweifeln, ob er es wirklich ist: „Bin ich überhaupt der Peaky? Und wenn ja, wieso fühlt es sich so an, als wäre ich mehrere …“ Es geht also um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Im vorliegenden HPLC-Tipp werden wir uns einfache Tests anschauen, die recht schnell durchzuführen sind: Keine Änderung der chromatographischen Parameter, keine Änderung der Apparatur. In den nächsten HPLC-Tipps werden wir uns sukzessiv mit aufwendigeren Methoden beschäftigen.

Die Lösung

Eine Veränderung von Einstellparameter („Settings“) kann helfen, innerhalb von Sekunden/Minuten die Peakhomogenität zu überprüfen. Es lohnt sich (auch) an solche „banale“, schnelle Möglichkeiten zu denken:

  1. Injektion bei einer anderen (niedrigeren) Wellenlänge, siehe Abbildung 1: Bei 271 nm erscheint der dritte Peak als ein Peak (unteres Chromatogramm), bei 225 nm sind zwei Peaks zu erkennen (oberes Chromatogramm)

 

2. Eine große Zeitkonstante („Filter Response“, „Filter Time Constant“) führt zwar zu einer ruhigeren Basislinie, die Peakbreite nimmt allerdings zu, man verliert an Auflösung. Folgendes Zahlenbeispiel aus einer „Technical Note“ von Waters, die freundlicherweise von Sascha Schifrin zur Verfügung gestellt wurde:
Kein digitales Filtern: Auflösung (Resolution) 3,16, Peakkapazität 16
Zeitkonstante, 0,5 Min: Auflösung 1,82, Peakkapazität 12

In Abbildung 2 werden beim Ausbleiben der Glättung – also kein digitales Filtern (quasi ein „ehrliches“ Chromatogramm) – bei 0,25 Min drei Peaks erkannt, bei einer Zeitkonstante von 0,7 Min nur ein Peak. Kommentar: Bei den modernen Geräten wird auch bei kleinen Zeitkonstanten kaum ein signifikant größeres Rauschen beobachtet.

  1. Ähnlich verhält sich die Datenrateaufnahme („Sample Rate“): Je höher die Anzahl der Datenpunkte, umso besser die Auflösung, umso stärker das Rauschen und umso schlechter die Reproduzierbarkeit der Peakfläche bei Wiederholinjektionen. In Abbildung 3 wird an der ansteigenden Flanke des ersten Peaks ein „Buckel“ bei 10 Hz erkannt, bei 2 Hz nicht.

 

4. Je größer der Spalt („Slit“) in nm beim PDA umso mehr Licht geht dadurch, umso besser die Empfindlichkeit, umso geringer die spektrale Auflösung. Das heißt, wenn ich eine gute Empfindlichkeit brauche (Reinheit, „winzige“ Peaks), sollte ich einen großen Wert für den Spalt wählen; möchte ich Spektren aufnehmen, sollte der Wert klein sein, z. B. 1,2 nm. In Abbildung 4 wird ein „Buckel“ am ersten großen Peak nach der Totzeit bei einem Spalt von 16 nm erkannt, nicht jedoch bei 8 nm, geschweige denn bei 4 nm. Bei kleinen nm-Werten verliert man also an chromatographischer Auflösung.

 

5. Erste und zweite Ableitung des betreffenden Peaks; diese Möglichkeit ist auch eine sehr schnelle, deswegen erwähne ich sie, obschon das Ergebnis nicht immer eindeutig ist. Als Ergänzung kann sie allerdings hilfreich sein. In Abbildung 5 zeigt der Peak (schwarz) ein leichtes Tailing. Wenn ein Peak homogen ist (UV-homogen …) sind die beiden Schenkel der 2. Ableitung (hier blau) gleich groß. Das ist hier nicht der Fall, möglicherweise handelt es sich um die Elution einer Verunreinigung am Tailing.

Bemerkung:

Der Einfluss der Einstellparameter macht sich vor allem bei kleinen, früh-eluierenden Peaks bemerkbar.

Einige Empfehlungen:

Zeitkonstante: 50 msec
Dwelltime bei LC-MS: 20-40 msec; längere Verweilzeiten führen zwar zu einer niedrigeren Nachweisgrenze aber auch zu einer niedrigeren Auflösung des Massenspektrums (analog dem Spalt beim PDA)
Datenrateaufnahme: HPLC, 10 Hz, UHPLC, mindestens 20 noch besser 50-100 Hz
Spalt: Aufnahme von UV-Spektren? Verwende 1,2-2 nm. Gute Empfindlichkeit (indirekt auch gute Auflösung) gewünscht? Verwende 16 nm
Wellenlänge: Naturgemäß abhängig von der Struktur, bei Verdacht auf polaren Molekülen tendenziell eher niedrige Wellenlängen

Das Fazit

Eine Änderung von Einstellparametern ist eine Sache von Sekunden, eine Peakinhomogenität kann evtl. dadurch schnell erkannt werden.

© Dr. Stavros Kromidas

sk
19. Februar 2025