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Gradient Archive - Seite 3 von 3 - Dr. Stavros Kromidas

Von 100% wässriger zu 100% organischer Phase – mögliche Probleme bei Gradientenläufen

Von A Fehlersuche, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Manche AnwenderInnen arbeiten im Gradienten-Modus mit vorgemischten Eluenten, manche legen jeweils 100% A (z. B. Puffer) und 100% B (z. B. ACN) vor und lassen das Gerät die gewünschte Mischung herstellen. Mit nicht-vorgemischten Eluenten kann es zu Problemen kommen, welche wären das und warum? Die Lösung Wenn 100% Puffer und 100% ACN zusammengeführt werden, besteht die Gefahr, dass in dünnen Kapillaren Salze ausfallen (z. B. ab ca. 85% ACN und mehr als 30-30 Mmol Puffer) Wird ein Gradient von 100% A auf 100% B gefahren, herrscht nicht nur der beabsichtigte Lösungsmittelgradient, sondern gleichzeitig ein pH-Wert- und ein Salzgradient….

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7. November 2004

Säulendimensionen und Gradiententrennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Wir haben uns bereits in diesem HPLC-Tipp über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der „Front“ veranlassen mich jedoch ein zweites Mal das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 x 4 mm, Fluss, 1 ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13-14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min x 20 min = 20 ml und 1,5…

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14. Oktober 2003

Säulenlänge, Fluss und Retentionszeiten bei Gradienten-Trennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Hintergrund Wichtig in der HPLC sind „vernünftige“ Wechselwirkungen. So heißt es beispielsweise für isokratische Trennungen: Die interessierenden Komponenten sollten mit einem Retentionsfaktor k, von ca. 2-8 eluieren. Hier haben wir einen sinnvollen Kompromiss zwischen ausreichend starken Wechselwirkungen, robusten Bedingungen und akzeptabler Retentionszeit. Bei Gradienten-Trennungen gilt analog der mittlere Retentionsfaktor : k = mittlerer k-Wert; Analyt befindet sich in der Mitte der Säule (Längsrichtung) tG = Gradientendauer [min] F = Fluss [ml/min] Vm = Säulenvolumen Δ%B = Änderung von B während der Gradientelution S = Steigung der -Kurve; für kleine Moleküle kann für ein Wert von ca. 5 angenommen…

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14. Juni 2003

Schnelle Optimierung einer bestehenden Gradientenmethode

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ich war einmal in einem befreundeten Unternehmen, in dem routinemäßig viele Gradientenmethoden laufen. Nicht alle waren aus Anwendersicht als zufriedenstellend zu bezeichnen. Wir wollten nun schauen, ob eine der häufig eingesetzten Methoden mit einem vertretbaren Aufwand verbessert werden könne, zumal die Anzahl der Proben sehr groß war. Der Versuch war erfolgreich. Ich möchte Ihnen nachfolgend zeigen, wie wir es bewerkstelligt haben, vielleicht können Sie davon profitieren. Die Lösung Abb. 1 stellt die Ausgangssituation dar: „Üblicher“ Methanol/Wasser-Gradient bei 1 ml/min, das Chromatogramm dauerte ohne Spülschritt ca. 16 min. Das war uns für zwei Peaks viel zu lang. Wir haben…

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8. Oktober 2002

Unbekanntes Trennproblem – wie soll ich anfangen?

Von ACN, B Optimierung, HPLC-Tipps, Nicht berücksichtigen, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Wasser

Der Fall Gehen wir von dem Fall aus, dass Sie eine Trennung „hinkriegen“ sollen. Dass die Zeit drängt, brauchen wir nicht zu erwähnen und dass Sie wenig über die Probe wissen, ist ebenfalls logisch….. Dass weiterhin die einzige HPLC-erfahrene Kollegin in Urlaub ist, versteht sich von selbst und der Laborleiter, der zufällig ein HPLC-Experte ist, weilt auf einer HPLC-Tagung und anschließend in Kur. Sie also, mutterseelenallein im Labor, ein Fläschchen mit einem unbekannten Etwas in der Hand und auf dem Schreibtisch ein Zettel mit einem riesigen EILT!. Wie sollte man so etwas anpacken – vorausgesetzt, Sie gehen nicht gleich nach…

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8. März 1998

Übernahme einer Gradientenmethode – der Einfluss der Appa­ratur

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Ein klassischer Fall: Sie übernehmen eine Gradientenmethode und, obwohl Sie pein­lichst auf Einhaltung aller chromatographischen Bedingungen achten, erhalten Sie mit Ihrer Anlage ein anderes Chromatogramm. Warum? Die Lösung Fast immer liegt der Grund in den unterschiedlichen Verweilvolumina (Verzögerungs­volumina, Delay Volume oder Dwell Volume) einmal Ihrer Anlage und zum anderen der Anlage, mit der die Methode entwickelt wurde. Als Verweilvolumen wird das Volumen vom Ort der Mischung der zwei Eluenten (Mischventil, Mischkammer, T-Stück) bis zur Säule be­zeichnet. Dieses kann je nach Hersteller von ein paar hundert Mikrolitern bis zu mehreren ml betragen! Die Hochdruckgradienten haben im Vergleich zu den…

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22. Oktober 1995