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Integration Archive - Dr. Stavros Kromidas

Die kleine Frage zur Validierung …

Von Allgemein, Einstellparameter, Monatstipp, Nachweisgrenze

„Wir haben bei der Bestimmung vom LOQ starke Schwankungen. Auch an unterschiedlichen Geräten und mit neuen Säulen. Woran kann das liegen? Als LOQ-Kriterium haben wir wie üblich ein S/N-Verhältnis von 10:1.“

Antwort:
Die Erfahrung zeigt, dass hier mit recht großen Integrationsfehlern zu rechnen ist.
Wir konnten zeigen (s. Infos am Ende des Beitrages), dass kaum eine kommerzielle Software in der Lage ist, bei automatischer Integration und einem S/N-Verhältnis von 10:1 so zu integrieren, dass der Fehler – bei optimalen (!) Bedingungen (BL-Trennung, kaum Drift usw.) – nicht mindestens 5-10 % beträgt. Siehe dazu weiter unten die Werte in der Tabelle für den ersten, kleinen Peak (oben): In den grau schraffierten Feldern befinden sich Werte mit einer Abweichung von mehr als 1 % vom richtigen Wert, bedingt durch eine fehlerhafte Integration.

 

Einige Kommentare und Erläuterungen zu den Werten der Tabelle:

  • Die verwendeten Einstellparameter („Settings“) wie Dwell-Time, Time Constant, Sample Rate usw. können – vor allem bei kleinen Peaks – die Integration beeinflussen. So ist beispielsweise die Abweichung vom richtigen Wert beim ersten Peak bei einem Threshold-Wert von 50 12,50 %, bei einem Threshold-Wert von 100 17,78 % (EZChrom)
  • Bei einigen Software-Programmen können unterschiedliche Integrationsalgorithmen angewandt werden. Die erhaltenen Ergebnisse können dabei recht stark abweichen, siehe z. B. die Werte der zwei Spalten bei Empower und Chromeleon (Waters, Dionex/Thermo). Das betrifft nicht nur absolute Abweichungen, es können sich sogar sowohl Unter- als auch Überbefunde ergeben
  • Erst ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 ist bei allen kommerziellen CDS (Chromatography-Data-Systems) der Integrationsfehler merklich kleiner 1 %

Fazit bzgl. Richtigkeit – wenn das Ziel zuverlässige Ergebnisse lautet:
– Bei symmetrischen, BL-getrennten Peaks liegt der Fehler durch die Integration erst
ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 gesichert unter 1 %
– Bei tailenden, Nicht-BL-getrennten Peaks – evtl. noch auf einer driftenden Basislinie –
ist ein S/N-Verhältnis von ca. 100:1 empfehlenswert.

Auch die Reproduzierbarkeit der Integration bei mehrfacher Injektion (Präzision) lässt bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 oft zu wünschen übrig.

Empfehlung bzgl. Reproduzierbarkeit von Ergebnissen am LOQ:
Injizieren Sie sechs Mal eine reale Probe und ermitteln bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 den Variationskoeffizienten (VK, RSD, Relative Standard Deviation). Frage: Genügt der resultierende VK bei diesen chromatographischen Bedingungen an dieser Apparatur und bei diesen Settings Ihren Anforderungen? Wenn nicht, wäre das S/N-Verhältnis so lange zu erhöhen, bis dies der Fall ist. Diese Konzentration kann dann als gesichert reproduzierbares LOQ (Limit Of Quantification, Bestimmungsgrenze) angesehen werden, die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wäre somit gegeben: Ihre Software kann bei dieser Konzentration reproduzierbar integrieren. Ein möglicher systematischer Fehler („Unrichtigkeit“ der Peakfläche und somit des Gehaltes) bleibt natürlich unerkannt, siehe dazu weiter oben „Richtigkeit“.
Merke:
Das in einigen regulierten Bereichen (FDA, ICH etc.) etablierte S/N-Verhältnis von 10:1 als Kriterium für LOQ basiert auf Richtlinien, es sind keine unverrückbare/gesetzliche Vorgaben: Es handelt sich ja um „Guidelines“ und nicht um „Regulation“/“Legal Requirements“. Es zeigt sich, dass mit Begründung ein größeres S/N-Verhältnis als Kriterium für LOQ von Auditoren/Inspektoren durchaus akzeptiert wird.

Weiterführende Infos und Angebote zum Thema „Validierung“: Artikel, Dokumente, Definitionen, Beratung, Bücher, Kurse

1. September 2025

Die „Kleinen“ im Sommer…

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Uncategorized

Temperatur, Einstellparameter Im Sommer beschäftigen wir uns ja traditionsgemäß mit kleinen Tipps. Als erstes, passend zur Jahreszeit, ein paar Bemerkungen zur Temperatur. Alsdann folgen zwei Beispiele die zeigen, dass bei Unkenntnis der Einstellparameter einer übernommenen Methode und Verwendung von anderen Zahlenwerten man evtl. keine übereinstimmenden Ergebnisse erhält. Das kann viel Zeit und Nerven bei Methodentransfers kosten. Es lohnt sich daher, gegenüber solchen Dingen ein wenig Sensibilität zu entwickeln. Temperatur Wir gehen davon aus, dass zwei Säulenöfen technisch in Ordnung sind, sie wurden vor kurzem qualifiziert. Bei gleicher Temperaturanzeige kann es dennoch zu unterschiedlichen Chromatogrammen kommen wenn das Funktionsprinzip der zwei…

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17. Juli 2018

Wie „richtig“ integriert meine Software?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Integration

Der Fall Wenn zwei oder mehr Peaks nicht Basislinie getrennt sind, ist die Integration mit Fehlern behaftet. Bei der Ermittlung der Peakfläche im Falle von gleich großen, symmetrischen Peaks und einem Valley zwischen den Peaks von kleiner 50 % der Peakhöhe beträgt der Fehler ca. 1-2 %. Dies dürfte kein ernstes Problem darstellen. Der Fehler bei tailenden, unterschiedlich großen und insbesondere sehr kleinen, sich an einer Drift befindenden Peaks kann allerdings in der Größenordnung von 50-60 % liegen (1). Man ist logischerweise unsicher und fragt sich, was denn das kleinere Übel ist: Lot fällen, Valley-to-Valley integrieren oder doch Tangential Skim anwenden?…

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16. Januar 2017

Peaks auf einer Flanke – mögliche Konsequenzen und Maßnahmen

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Integration, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Manch´ ein Peak eluiert auf einer Flanke. Die Flanke kann u.a. ein abfallender Gradient, ein sehr langsam eluierender Peak oder einfach Matrix sein. Angenommen, das Problem ist chromatographisch nicht zu lösen, wie könnte man vorgehen, um den Fehler bei der Bestimmung der Peakfläche zu minimieren? Die Lösung Im Falle vom Gradienten haben wir an dieser Stelle bereits darüber gesprochen, wie eine Lösung aussehen könnte: Blindgradient bzw. das Chromatogramm einer Matrixinjektion (Matrixlösung ohne Probe) vom Original-Chromatogramm abziehen und das Differenz-Chromatogramm integrieren. Hier möchte ich kurz auf zwei etwas anders gelagerte Fälle eingehen. Fall 1 In Abb. 1 sind sechs…

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25. November 2012

„Slit“, „Bandwidth“ und Referenzwellenlänge beim Diodenarray – Einstellungen und Effekte

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Nachweisgrenze

Der Fall Die oben genannten Einstellparameter beeinflussen die Integration – und somit die Peakfläche – aber auch die Streuung der Werte bei Wiederholmessungen, siehe dazu diesen HPLC-Tipp. Hier wollen wir uns mit den Effekten bei großen/kleinen Werten beschäftigen, welche Vor-Nachteile ergeben sich nun? Die Lösung Es folgen zunächst kurze Erläuterungen für Eeinsteiger-KollegInnen (Hinweis: In den Gerätehandbüchern finden sich in der Regel ausführliche Erklärungen mit Illustrationen und Beispielen): Bandbreite („Bandwidth“): Dieser Wert ist ein Maß für die Anzahl der Dioden, die zur Mittelung benutzt werden, um das Signal bei einer bestimmten Wellenlänge wider zu geben Spalt („Slit“): Der Spalt durch den das…

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26. April 2011

Einstellparameter und Variationskoeffizient

Von A Fehlersuche, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Variationskoeffizient (Vk)

Der Fall Einstellparameter wie Zeitkonstante („time constant“), Peakwidth, Datenrateaufnahme („sample rate“), Bandwidth etc. können die Integration und somit Peakfläche und Befund stark beeinflussen. Wir haben uns bereits darüber unterhalten, Details finden sich in (1), (2) und (3). In wie weit beeinflussen nun diese Parameter auch die Streuung der Werte im Falle von Wiederholmessungen? Die Lösung Nachdem ich in der Literatur diesbezüglich nicht fündig geworden bin, wurde in einer kleinen Studie an einer UPLC-Anlage der Einfluss diverser Einstellparameter auf den Vk systematisch untersucht. Dazu wurde zunächst mithilfe von Systemeignungstests die Zuverlässigkeit der Anlage überprüft. Anschließend wurden aus einem vial je 10…

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27. September 2010

Integration von Peaks auf einer driftenden Basislinie

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Integration

Der Fall Bei Gradiententrennungen oder im Falle von Matrix-belasteten Proben müssen oft Peaks, die sich auf einer mehr oder weniger stark driftenden Basislinie oder auf einem flachen „Buckel“ befinden, integriert werden. Die Frage ist nun, wie tut man so etwas am besten? Da die meisten Anwender nicht über Peakhöhen auswerten, wird hier auf diese – oft sinnvolle – Möglichkeit nicht weiter eingegangen. Die Lösung Nachfolgend werden für zwei Fälle Lösungsansätze vorgeschlagen, die sich nach aufwendigen Überprüfungen als das kleinere Übel erwiesen haben (1). 1. Nicht-aufgelöste Peaks auf einer abfallenden Basislinie, s. Abb. 1. (Das Beispiel wurde freundlicherweise von Hans-Joachim Kuss…

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29. Januar 2010

Einfluss von Einstellparametern auf die Trennung

Von A Fehlersuche, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, kleine Peaks, Methodentransfer, Nachweisgrenze, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Im diesem Tipp ging es um den Einfluss von Einstellparametern auf die Peakform und damit auch auf die Auflösung. So „verschwinden“ schmale, früh eluierende Peaks bei zu groß eingestellten Werten für die Zeitkonstante (z. B. 0,7-1 s) bzw. zu kleinen Datenraten (z. B. 1-2 Hz). Nun mache ich in Seminaren und Workshops die Erfahrung, dass auch erfahrene Anwender die Brisanz der Einstellparameter unterschätzen. Deswegen greife ich hier das Thema erneut auf und gehe kurz auf den Einfluss der Bandbreite (engl. „bandwidth“) bei einem Dioden Array Detektor auf das chromatographische Ergebnis ein. Die Lösung Abb. 1 Zum Einfluss der…

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29. März 2009

Empfehlungen in Geräte-Handbüchern – seien Sie etwas vorsichtig!

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Handbücher von Gerätehersteller sind meist sehr nützlich – zwar manchmal viel zu umfangreich und von Softwarespezialisten statt von Analytikern verfasst, aber dennoch: Manches wird erst nach deren Lektüre wirklich klar. Trotzdem ist Vorsicht geboten: Einige Empfehlungen sind irreführend oder einfach falsch. Welche Beispiele könnte man diesbezüglich anführen ? Die Lösung Dergleichen gibt es einiges, hier möchte ich beispielhaft auf zwei Empfehlungen bzgl. Einstellparameter eingehen: 1. In manch einem Manual steht, dass ein Peak mit 20-25 Datenpunkten ausreichend darstellbar sei. Dies stimmt jedoch nicht für schnelle Peaks. Bei einer Peakbreite von z. B. 9 s im Falle eines schnell…

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7. September 2008

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Integration, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Variationskoeffizient (Vk)

Der Fall In diesem Peak haben wir uns mit physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigt, die beim Methodentransfer zu unterschiedlichen Flächen (und somit zu unterschiedlichen Gehalten) führen  – trotz technisch einwandfreier Hardware. Hier geht es um Probleme bei der Anwendung der Methode, einmal durch unterschiedliche Zahlenwerte innerhalb der Spezifikationsanforderungen und einmal durch Unterschiede bei den Einstellparametern, sowohl was die Datenaufnahme als auch die Integration betrifft. 1. Spezifikationsanforderungen Betrachten wir als Beispiel folgende Anforderungen in einer Prüfvorschrift: „ pH-Wert des Eluenten 4,5 +/- 0,1 pH-Einheiten, Tailingfaktor des Hauptpeaks kleiner/gleich 1,3, Auflösung R zwischen Hauptpeak und Verunreinigung größer/gleich 1,5“. Im Extremfall – aber immer noch innerhalb…

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7. März 2008