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Zwei Peaks in der Säule…

By HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe Anwenderinnen, liebe Anwender, es ist eine Weile her, dass wir von den zwei Peaks, Peaky und Chromy, etwas gehört haben. Heute jedoch sind die zwei recht ungleichen Freunde wieder beisammen: Zum Einen der kleine Peaky Säure aus Polarweiler, wie eh und je quirlig, ungeduldig, frech und mit einem für ihn typisch losen Mundwerk, welches man ihm leider nicht mehr abgewöhnen kann. Und zum Anderen Chromy von Kieselhausen aus Hydrophobingen, groß, ruhig, höflich, ein Herr von Format, ein Gentleman der alten Schule. Beide sitzen nun seit kurzem auf zwei unterschiedlichen Borsten-Stühlen im „Cafe de bifunktionale Colona“ – jenem berühmten langgestreckten…

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26. Dezember 2010

Sind ein kleines „Delay Volume“ der Apparatur und/oder ein kleines Volumen der Mischkammer immer „gut“? oder: Was ein Paar „Mikroliterchen“ alles bewirken können…

By A Fehlersuche, Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Im Zuge der Verbreitung von UHPLC-Geräten warten die Hersteller mit immer kleineren Verweilvolumina (Verweilvolumen, auch: Verzögerungsvolumen, „Delay Volume“, „Dwell Volume“, das ist das Volumen von der Mischkammer bis zur Säule) bzw. Volumina der Mischkammer (35 – ca. 60 µl) auf. Da ist zunächst nichts dagegen einzuwenden. Kleine Volumina können jedoch auch Nachteile mit sich bringen. Dabei denke ich im Moment nicht an eine erhöhte Gefahr für Niederschläge im Falle von starken Puffern. Und auch nicht an eine schlechte Mischungsqualität imfalle von großen Unterschieden in der Viskosität der zu mischenden Lösungsmittel in Kombination mit einem kleinen Volumen der Mischkammer….

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26. November 2010

Unterschiede in den HPLC-Anlagen – die Peakfläche

By A Fehlersuche, Chromatogramm, Fluss, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Dass Geräte von unterschiedlichen Herstellern große Unterschiede aufweisen können, ist eine HPLC-Binsenweisheit. Der Unterschied kann im Verweilvolumen bei Gradientenanlagen liegen (Hochdruck vs. Niederdruck), in der Richtigkeit bei der Wellenlängeneinstellung (z. B. +/- 2 nm vs. +/- 4 nm), im Material der Nadel im Probengeber (z. B. Stahl vs. Keramik) und damit verbunden evtl. Memoryeffekte, in der unterschiedlichen Geometrie der Mischkammer oder der Detektorzelle bei u. U. identischem Volumen und, und…Diese Unterschiede sowie die Folgen sind erfahrenen AnwenderInnen bekannt: Unterschiede in der Retentionszeit, in der Peakfläche und in der Peakform. Im hiesigen Peak möchte ich gerne auf zwei Sachen…

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26. Oktober 2010

Einstellparameter und Variationskoeffizient

By A Fehlersuche, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Variationskoeffizient (Vk)

Der Fall Einstellparameter wie Zeitkonstante („time constant“), Peakwidth, Datenrateaufnahme („sample rate“), Bandwidth etc. können die Integration und somit Peakfläche und Befund stark beeinflussen. Wir haben uns bereits darüber unterhalten, Details finden sich in (1), (2) und (3). In wie weit beeinflussen nun diese Parameter auch die Streuung der Werte im Falle von Wiederholmessungen? Die Lösung Nachdem ich in der Literatur diesbezüglich nicht fündig geworden bin, wurde in einer kleinen Studie an einer UPLC-Anlage der Einfluss diverser Einstellparameter auf den Vk systematisch untersucht. Dazu wurde zunächst mithilfe von Systemeignungstests die Zuverlässigkeit der Anlage überprüft. Anschließend wurden aus einem vial je 10…

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27. September 2010

Die „Kleinen“ im Sommer

By A Fehlersuche, Eluent, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Lösungsmittel, Uncategorized

Der Eluent ist eine schier unendliche Geschichte… 1. Von „Gebirgen“ in der Basislinie und Läufe im Sommer und im Winter imfalle von ACN/Wasser-Eluenten Der Fall Sagen wir, Ihnen ist aufgefallen, dass Sie im Sommer mit ACN/Wasser- bzw. Puffer-Gemischen mehr Probleme haben als im Winter: Basislinieschwankungen, evtl. zusätzliche, breite Peaks etc. Mögliche Erklärung: Eine frisch hergestellte Mischung beispielsweise von 85/15 ACN/Wasser- bzw. Puffer ist bekanntlich kalt und wir haben zunächst auch keine Probleme. Es kann nun passieren, dass im Sommer trotz Klima-Anlage die Temperatur im Labor 27-29 °C beträgt. Die höhere Temperatur begünstigt die Bildung von Polymeren – ein bekanntes Problem…

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27. Juli 2010

Die „Kleinen“ im Sommer

By A Fehlersuche, Eluent, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Uncategorized

Tipps rund um den Eluenten Es hat sich gezeigt, dass imfalle von ternären Mischungen bei bestimmten Mischverhältnissen die Dichtungen „streiken“, z. B: Eine Mischung 25/25/50 MeOH/ACN/Wasser führt zu Leckagen, nach dem Wechsel jedoch zu einer Mischung 10/40/50 MeOH/ACN/Wasser ist wieder alles in Lot Die Peakform von basischen Analyten lässt manchmal auch bei Verwendung von modernen stationären Phasen zu wünschen übrig. Durch eine Erhöhung der Ionenkonzentration im Eluenten wird die Peaksymmetrie besser, man möchte allerdings nicht unbedingt die Pufferstärke verändern, was ja auch Erhöhung der Ionenkonzentration bedeuten würde. Man könnte nun folgendes tun: Zum Wasser (oder zum Puffer) werden ca. 2…

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27. Juni 2010

Überprüfung der Säulenstabilität in der RP-HPLC

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Robustheit

Der Fall In der Routine werden AnwenderInnen immer wieder mit folgender Situation konfrontiert: Die Lebensdauer manch´ einer Säule lässt zu wünschen übrig. Und dies obwohl die Methode validiert und die Robustheit überprüft worden ist. Der Grund liegt oft darin, dass bei der Überprüfung der Robustheit einer Methode zwar Methodenparameter wie pH-Wert, Eluentenzusammensetzung, Säulencharge, Temperatur etc. im Focus stehen, die Säulenstabilität jedoch nicht als prüfenswert erachtet wird. Das Ergebnis: Eine wunderbar selektive Säule erweist sich ob ihrer geringen Lebensdauer für einen Routineeinsatz einfach als ungeeignet. Wie kann nun die Säulenstabilität geprüft werden? Die Lösung Man bedient sich eines 3-Stufen Plans: 1….

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27. Mai 2010

Das kann mit der Probe in der Säule passieren

By A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probe

Der Fall Kieselgel ist ein sehr guter Feststoffkatalysator, er wird vielfach in der chemischen Industrie eingesetzt. In der RP-Chromatographie nun, wo ja Kieselgel die mit Abstand wichtigste Matrix darstellt, führt seine Umsetzung mit Silanen aufgrund von sterischen Effekten zu einem Umsetzungsgrad von lediglich ca. 50-70%. Das bedeutet, dass RP-stationäre Phasen eine „nackte“ Kieselgeloberfläche von immerhin ca. 30-50% aufweisen können. Die katalytische Wirkung von Kieselgel kann dazu führen, dass manch eine Substanz in der Säule chemisch verändert wird. Das Ergebnis: Peaks, die im Chromatogramm erscheinen, könnten Substanzen sein, die in der Säule durch die katalytische Wirkung des Kieselgels entstanden sind und…

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27. April 2010

HILIC und Co… oder: HILIC ist nicht gleich HILIC!

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, polare Komponenten, Stationäre Phase

Der Fall Die Trennung von stark polaren Komponenten mittels HPLC stellt oft eine echte Herausforderung dar. Nachfolgend stichwortartig einige Möglichkeiten: RP-Modus Wasseranteil sowie Salzkonzentration im Eluenten erhöhen (z. B. bis 90%, bei bestimmten stationären Phasen bis 95-100% Wasser/Puffer möglich). Dadurch wird der Eluent sehr polar und die Analyte – die ja stets eine erhöhte Hydrophobie im Vergleich zum polaren Eluenten aufweisen – werden zu hydrophoben Wechselwirkungen mit der stationären Phase „gezwungen“. PH-Wert verändern bzw. – wenn es denn unbedingt sein muss… – Ionenpaarreagenzien verwenden. Dadurch wird eine saure/basische Komponente neutralisiert bzw. maskiert, auch hier ist das Ergebnis die Verstärkung von neutralen/hydrophoben…

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29. März 2010

Effektives Spülen einer RP-HPLC-Säule

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Dass eine HPLC-Säule ab und zu gespült werden muss, ist eine Binsenweisheit. Nur, wie macht man so etwas effektiv – es soll gründlich und es soll auch ökonomisch sein. Wenn Sie im Labor eine entsprechende Spülprozedur haben mit der Sie zufrieden sind, besteht natürlich kein Handlungsbedarf. Und Sie sind wahrscheinlich zufrieden, wenn Sie erstens bei Ihren Läufen keine Geisterpeaks, keinen Memoryeffekt, keine „Buckel“ etc. feststellen und zweitens die ganze „Spülerei“ keine 2-3 Stunden in Anspruch nimmt. Sollte allerdings einer dieser zwei Fakten zutreffen, bestünde womöglich Optimierungspotenzial. Nachfolgend finden Sie einen Vorschlag. Die Lösung 1. Verunreinigungen Vorbemerkung als Erinnerung…

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21. Februar 2010