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Apparative Notwendigkeiten für schnelle, schmale Peaks

By B Optimierung, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Miniaturisierung in der HPLC ist seit langem ein zeitloses Thema…  Die Diskussion ist zwar seit Mitte der 1970er Jahre im Gange, doch werden erst in der jüngeren Vergangenheit neben den entsprechenden Geräten auch eine Reihe von Säulen mit den Dimensionen 10-20 mm Länge, 1,0-2,1 mm Innendurchmesser und Sub 2 µm Teilchen in bemerkenswerter Vielfalt angeboten. Bei solchen Säulen haben wir natürlich mit sehr kurzen Analysezeiten und schmalen Peaks zu tun. Bemerkung: Kapillarsäulen, „Pillar Array Columns“, „Column On a Chip“ sind in der Routine (noch) eher selten, daher werde ich hier nicht darauf eingehen. Was sind nun die (apparativen)…

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7. Mai 2005

Wie lange sollte die übliche Equilibrierzeit bei einer RP-Säule sein?

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Eine RP-Säule ist häufig zu equilibrieren: Beim „Einfahren“, wenn sie neu ist, beim Umspülen, wenn ein neuer Eluent eingesetzt wird, nach einem Gradientenlauf vor der nächsten Injektion, wenn sie nach getaner Arbeit gelagert wird usw. Wie lange sollte dieser Vorgang nun dauern? Die Lösung Halten wir zunächst folgendes fest: Die Frage sollte weniger lauten „wie lange?“ sondern viel mehr „wie viel Volumen sollte ich über die Säule schicken?“ Beim Einfahren, Um- bzw. Spülen gilt als Faustregel: Ca. 10-15 Säulenvolumina pro Spülschritt bei einfachen Eluenten bzw. üblichen Verunreinigungen und 30-50 Säulenvolumina pro Spülschritt im Falle von komplexeren Eluenten bzw….

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7. April 2005

Ungewöhnliche Ursachen für Geisterpeaks/Spikes

By A Fehlersuche, Chromatogramm, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Der Fall Geisterpeaks bzw. Spikes sind eine häufige, ärgerliche Sache. Wir haben uns des Öfteren über dieses Problem unterhalten. Nun, man sollte in einem solchen Fall nicht nur an bekannte Quellen sondern – vor allem im Falle von unregelmäßig auftretenden Geisterpeaks – auch an ungewöhnliche Quellen denken, die mit der eigentlichen HPLC-Arbeit wenig zu tun haben. Was wären das? Die Lösung Nachfolgend werden kurz einige Ursachen für Geisterpeaks/Spikes genannt, an die man eher selten denken würde. Diese Beispiele basieren auf reale Fälle. Periodisch erscheinende Spikes, die Klima-Anlage und sonstige Geräte in der unmittelbaren Umgebung der HPLC-Anlage können als Ursache ausgeschlossen…

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7. März 2005

Ursachen für mangelnde Robustheit

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Robustheit

Der Fall Sie übernehmen eine validierte Methode, die allerdings im Laufe der Zeit sich nicht als sonderlich robust erweist. Wieso gibt es immer wieder Probleme mit der Robustheit von validierten bzw. offiziellen Methoden, z. B. Arzneibuchmethoden? Die Lösung Das grundsätzliche Problem – eher ein Management- denn ein analytisches Problem – besteht darin, dass die Zeit, die für die Validierung einer Methode zur Verfügung steht, meist nicht ausreicht, um die Eignung besagter Methode unter Routinebedingungen zu überprüfen. Eine „Validierung“ unter optimalen Bedingungen und zusätzlich unter Zeitdruck liefert unweigerlich „Sonntagswerte“, die mit dem realen Alltag denkbar wenig zu tun haben. Das Validierungselement…

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7. Februar 2005

Ein HPLC-Tag im Dezember 2014

By HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe Leserinnen, liebe Leser, diesen HPLC-Tipp habe ich im Dezember 2004 geschrieben und einen (nicht ganz ernst gemeinten und bewusst übertriebenen) Blick auf die HPLC des Jahres 2014 skizziert. Es ist zwar heute alles „Schnee von gestern“ aber als „historischen“ Text lasse ich auch diesen Tipp in unserer Datenbank drin… „Es kommt nicht darauf an, die Zukunft vorherzusagen, sondern auf die Zukunft vorbereitet zu sein“ Perikles Getreu unserer Tradition werden wir in der Dezember-Ausgabe uns nicht mit Fachlichem im strengeren Sinne beschäftigen, sondern einem Thema in einer etwas lockeren Art nähern und somit das Jahr ein wenig ruhig ausklingen lassen….

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7. Dezember 2004

Von 100% wässriger zu 100% organischer Phase – mögliche Probleme bei Gradientenläufen

By A Fehlersuche, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Manche AnwenderInnen arbeiten im Gradienten-Modus mit vorgemischten Eluenten, manche legen jeweils 100% A (z. B. Puffer) und 100% B (z. B. ACN) vor und lassen das Gerät die gewünschte Mischung herstellen. Mit nicht-vorgemischten Eluenten kann es zu Problemen kommen, welche wären das und warum? Die Lösung Wenn 100% Puffer und 100% ACN zusammengeführt werden, besteht die Gefahr, dass in dünnen Kapillaren Salze ausfallen (z. B. ab ca. 85% ACN und mehr als 30-30 Mmol Puffer) Wird ein Gradient von 100% A auf 100% B gefahren, herrscht nicht nur der beabsichtigte Lösungsmittelgradient, sondern gleichzeitig ein pH-Wert- und ein Salzgradient….

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7. November 2004

LC-MS-Kopplung – Die Eigenarten der wichtigsten Interfaces, Schlussfolgerungen

By ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Es liegt auf der Hand, dass das Interface das Herzstück der LC-MS-Kopplung darstellt, hängt doch von seinem „Können“ Empfindlichkeit und Spezifität der Aussage ab. Es ist weiterhin klar, dass durch den unterschiedlichen Aufbau und die Funktionsweise auch unterschiedliche Aspekte wichtig bzw. kritisch sind. Welche Dinge sollte man sich aus Anwendersicht merken? Die Lösung 1. Elektrospray (ESI) Die Ionisierung des Analyten erfolgt via pH-Wert, optimal ist ein pH-Wert um +/- 0,5 pH-Einheiten vom pKs-Wert entfernt Das organische Lösungsmittel beeinflusst die Ionisation nur gering – verwenden Sie MeOH oder ACN je nach chromatographischer Notwendigkeit Hoher organischer Anteil im Eluenten verhindert…

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7. Oktober 2004

LC-MS-Kopplung – Matrix-Einfluss, das Problem der Empfindlichkeit

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Die LC-MS-Kopplung wird naturgemäß – abgesehen von Spezialfällen wie z. B. LC-MS als „Peakseparator“ für Fraktionierungen in der präparativen HPLC – zur Überprüfung der Peakhomogenität und zur Substanzidentifizierung eingesetzt. Dies geschieht häufig im Spurenbereich, z. B. Zersetzungs- und Nebenprodukte, Metabolite, unbekannte Verunreinigungen (Target/Non-Target-Analytik). In solchen Fällen gilt, jeglichen Verlust an Empfindlichkeit zu vermeiden. Welche Möglichkeiten gibt es nun dafür? Die Lösung Nachfolgend sind einige Hinweise stichwortartig aufgelistet. Matrix Überprüfen Sie eine evtl. Ionisationsunterdrückung durch die Matrix: Eine Standardlösung wird mit Hilfe einer zweiten Pumpe und eines T-Stückes dem Eluenten nach der Säule zudosiert. Nachdem die Basislinie konstant ist,…

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7. September 2004

LC-MS-Kopplung – wie mache ich aus einer HPLC- eine LC-MS-Methode?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Vorbemerkung Die LC-MS-Kopplung wird immer wichtiger. War diese Technik noch Anfang der 2000er Jahre eine Rarität von und für Spezialisten, wird sie zunehmend zu einer Notwendigkeit in Entwicklungslabors, auch in der Routine gewinnt sie an Bedeutung: Routine-LC-MS-Geräte sind in der Zwischenzeit günstig, kompakt, robust und arbeiten recht zuverlässig. Aus diesem Grunde habe ich mich entschlossen, auf einige der häufigsten Fragen, die mir bzgl. LC-MS gestellt werden, in hiesigen sowie in diesem und in diesem HPLC-Tipp in komprimierter Form und aus praktischer Sicht einzugehen. Selbstverständlich bedarf es für eine detaillierte Auseinandersetzung mit dieser Technik des Besuchs entsprechender Seminare bzw. des Studiums von Infomaterial…

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7. August 2004

Überprüfung der Robustheit von Systemen mit gepufferten Eluenten

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, Robustheit, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Je komplexer der Mechanismus bei der Wechselwirkung eines Analyten mit der stationären Phase ist, um so labiler sind die Gleichgewichte, um so anfälliger ist die Methode. Mit anderen Worten: Die Robustheit in solchen Systemen ist ein durchaus kritischer Punkt. Es ist sicherlich bekannt, dass im Rahmen der Überprüfung der Robustheit von Methoden mit gepufferten Eluenten u.a. auch der pH-Wert im relevanten Bereich variiert werden sollte. Wie kann man hier ökonomisch vorgehen? Die Lösung Besorgen Sie sich die pKs-Werte Ihrer Substanzen! Wenn diese nicht vorliegen, lohnt es sich schon beim Auftraggeber nachzufragen oder bei Bedarf jene mit Hilfe der…

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7. Juli 2004