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Sind 40 °C gleich „40 °C“?

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine Retentionszeitverschiebung hat mehrere Gründe, darüber haben wir uns häufiger unterhalten. Einer der Gründe ist eine Differenz bei der aktuellen Trenntemperatur. So weit so gut. Sie übernehmen nun eine Methode mit der Angabe „40 °C“ und stellen dementsprechend Ihren Säulenofen auf 40 °C ein. Stellen Sie nun fest, dass die Retentionszeit sich etwas verschoben hat, so würden Sie kaum eine Temperaturdifferenz als Ursache annehmen, die Temperatur-Anzeige ist ja in Ordnung und das Gerät ist qualifiziert! Tun Sie mir und Ihnen den Gefallen und seien Sie hier etwas vorsichtig. Jetzt fragen Sie sich, „ist denn 40 °C nicht gleich…

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10. August 1999

Systematische Vorgehensweise beim Auftreten von Problemen

By A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten im Routinelabor und stehen immer wieder vor Problemen. Natürlich wäre optimal, wenn Sie sofort die Lösung hätten. Sofort-Lösungen zu erhalten ist jedoch äußerst selten im Leben und konkrete Tipps bekommen Sie (vielleicht) beim Studium von Fachbüchern, von erfahrenen KollegInnen oder im Rahmen von Weiterbildungsveranstaltungen. Nachfolgend schlage ich Ihnen ein Strategie-Schema vor, wie man vorgehen kann. Auch wenn es auf den ersten Blick theoretisch und recht allgemein erscheinen mag, hilft eine solche oder ähnliche systematische Vorgehensweise sehr. Diagnose von und Umgang mit HPLC-Fehlern Problem wiederholbar? Wann tritt das Problem auf? Nur freitags, nur bei mir usw? Symptome…

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9. Mai 1999

Was ist der Unterschied zwischen Totzeit und Totvolumen, Selektivität und Auflösung?

By Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps

Der Fall Ich mache immer wieder die Erfahrung, dass eine Reihe von Begriffen im HPLC-Alltag nicht einheitlich benutzt werden. Das führt unweigerlich zu Missverständnissen. Daher mein Anliegen hier, dass wir wenigstens ein Paar dieser Begriffe „sauber“ definieren. Die Lösung Totzeit, to oder tm (Lösungsmittelpeak, Front, Durchbruchszeit, Mobilzeit) ist die Aufenthaltszeit aller Komponenten im Eluenten. Sie ist für alle Komponenten gleich. Anders formuliert: Das ist die Zeit für eine inerte Komponente; inerte Komponente ist eine Komponente, die in alle Poren des Füllmaterials hinein diffundieren kann, aber keine Wechselwirkung mit der stationären Phase eingeht. Eine solche Komponente kann folglich sich nur im…

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14. April 1999

Je älter desto besser: Beim Portwein sicher, beim Rotwein vielleicht – und bei einer C18-Säule?

By Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die Erfahrung lehrt, dass mit der Zeit die Qualität einer HPLC-Säule abnimmt, die Peaks werden breiter. Ist auch der umgekehrte Fall denkbar? Die Lösung Ja. Halten wir nun folgendes fest: Die Aussage, „die C18-Säule ist schlechter geworden“ kann zweierlei bedeuten. Zum einen kann es sich um eine mechanische Beanspruchung der Packung handeln, deren Ausmaß im wesentlichen von dem Fluss, dem Druck, der Temperatur, der Anzahl der Injektionen und dem Betriebsmodus (isokratischer-/Gradientenbetrieb) abhängt. Lässt nun die Qualität der Packung nach, so manifestiert sich dies mit Peakverbreiterung und/oder Tailling, evtl. sogar mit Doppelpeaks – die Retentionszeit bleibt dabei konstant. Zum…

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4. März 1999

Was ändert sich am Chromatogramm, wenn das Totvolumen einer isokratischen Anlage größer ist als bei einer anderen?

By A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine isokratische Methode soll auf ein anderes Gerät übertragen werden; die aktuelle Apparatur weist ein um 100 μl größeres Totvolumen auf, als die Apparatur, an der die Methode entwickelt wurde. Muss man mit merklichen Unterschieden im Chromatogramm rechnen und wenn ja mit welchen? Die Lösung Ein Totvolumen führt bekanntlich zu Peakverbreiterung, die Auflösung wird schlechter evtl. sogar unzureichend bei früh eluierenden, kritischen Peaks. Was kann noch passieren? Die Retentionsfaktoren (k-Werte, relative Retention) nehmen auch ab. Erläuterung: Es gilt: k Retentionsfaktor (früher: Kapazitätsfaktor, k‘) tR Retentionszeit einer Komponente tm Totzeit (Retentionszeit einer inerten Komponente) Durch eine Vergrößerung des Totvolumens…

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10. Januar 1999

3 μm Material – reif für die Routine?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Säule, Stationäre Phase

Der Fall In HPLC-Kursen werde ich mit Fragen konfrontiert, die sicherlich auch andere Anwender beschäftigen. Eine lautete vor kurzem: “ In letzter Zeit tauchen immer häufiger in Prospekten Werbetexte mit Vorteilen der 3 gegenüber den 5 μm-Materialien auf. Sind sie für die Routine tatsächlich reif?“ Die Lösung Ja, wenn bestimmte Voraussetzungen erfüllt sind. Vorbemerkung: Die Rede ist von 3 μm, doch beträgt bei den meisten Materialien der mittlere Partikeldurchmesser tatsächlich 3,5 μm. Der Grund: Das 3,5 μm Material „passt“ gerade nicht durch die verbreiteten und allgemein verwendeten Fritten und Filter. Eine weitere Herabsetzung des Partikeldurchmessers würde eine Änderung von Gewohnheiten…

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14. Oktober 1998

Die Peaks kommen mit der neuen, „identischen“ Säule später – warum?

By A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie haben eine neue Säule bestellt, die soeben angekommen ist. Obwohl Sie die gleiche Säule (stationäre Phase und Säulendimensionen) bestellt haben, und Sie dem Lieferanten auch treu geblieben sind, kommen die Peaks trotz konstant gehaltener chromatographischer Bedingungen später. Warum? Die Lösung Nehmen wir an, dass die chromatographischen Bedingungen (Temperatur, Eluent incl. pH-Wert, Pufferstärke usw. ) und auch die Probenvorbereitung tatsächlich konstant geblieben sind. Überprüfen Sie nun, ob die Totzeit (Frontpeak, Durchbruch) auch später eluiert. Ist das der Fall, dann ist wahrscheinlich der Fluss nicht mehr konstant: Schauen Sie nach Luft in der Pumpe bzw. nach einer Leckage. Stellen…

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14. August 1998

Peaks kommen zu früh – was tun?

By B Optimierung, HPLC-Tipps, polare Komponenten

Der Fall Nehmen wir an, ein Peak (oder verstecken sich mehr darunter?) kommt in einem RP-System (C18, ACN/Phosphatpuffer 30/70) zu früh. Es handelt sich offensichtlich um eine oder mehrere sehr polare Komponenten. Wie kann nun dessen/deren Retentionszeit erhöht werden? Die Lösung Chromatographische Parameter verändern: Längere Säule, langsamerer Fluss, niedrige Temperatur – das sind Stoff-unspezifische, recht schnell zu realisierende Massnahmen. Stationäre Phase verändern: – Material mit kleinerem Porendurchmesser einsetzen, z. B. Si 60 Å, statt Si 120 Å; dadurch nimmt die spezifische Oberfläche zu und demnach auch die Wechselwirkungen. – Nicht-endcappedes Material einsetzen. Die (vermeintlich) ionischen Komponenten können mit freien Silanolgruppen…

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8. Juli 1998

Ungewollte pH-Verschiebung – die Konsequenzen

By A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die unbeabsichtigte pH-Verschiebung im Eluenten ist einer der häufigsten Gründe für mangelnde Robustheit in der RP-Chromatographie. In diesem HPLC-Tipp geht es um die Ursachen für eine pH-Verschiebung sowie über das Ausmaß. Hier wollen wir uns etwas genauer mit der Änderung der Peakgröße befassen. Die Lösung Eine pH-Wert-Verschiebung kann zu unterschiedlicher Signalgröße (Peakfläche) führen, denn die UV-Absorption polarer Komponenten kann pH-Wert abhängig sein. In Abb. 1 wird das Spektrum der L-Ascorbinsäure bei unterschiedlichen pH-Werten gezeigt. Betrachten wir den pH-Wert-Bereich, der für die HPLC relevant ist, pH = 2-9. Im Alkalischen hätten wir beispielsweise bei 240 nm einen kleinen Peak,…

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7. Juni 1998

Die „Last“ mit den kleinen Peaks

By B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, kleine Peaks

Der Fall „Small is beautiful“. Das mag stimmen bei Kindern, Katzen, Hunden, Marienkäfern und Ähnlichem. Bei den Teilchen einer Packung sicherlich auch. Beim Häuschen im Grünen ging’s vielleicht auch noch, beim Auto kommen die ersten Zweifel auf. Spätestens bei Peaks hört die Zustimmung für obigen Spruch auf. Wie man solche „vergrößern“ kann, ist ausführlich im Tipp zur Nachweisgrenze beschrieben. Was ist nun wirklich das Problem mit den kleinen Peaks? Die Lösung Halten wir zunächst folgende Tatsache fest: Kleine Peaks, die nicht erkannt werden, führen zu falschen Aussagen über die Reinheit von Proben. Gibt es nun Probleme im Fall von Peaks, die…

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14. April 1998