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Kategorie

Gradient

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, ACN, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel

Probleme, die direkt oder indirekt mit dem Lösungsmittel Acetonitril zu tun haben Fall 1 In einem kleinen Labor, das vom Platz her gar nicht dafür ausgelegt ist, befinden sich 6 HPLC-Geräte. Die KollegInnen dort haben immer wieder Probleme mit Retentionszeitverschiebungen und Reproduzierbarkeitsprobleme bezüglich Peakfläche. Der Grund: Die Klimaanlage schafft es einfach nicht. Im kleinen Raum ist es wegen der Wärmeentwicklung durch die Geräte recht warm. Ergebnis: Unreproduzierbare Herstellung des Eluenten, Verdampfen von Acetonitril, das als Probelösungsmittel verwendet wird und dadurch Aufkonzentrierung der Probelösung. Eine Lösung des Problems ist kurzfristig leider nicht in Sicht. Fall 2 Zwei Labors sollten eine Applikation…

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7. Juni 2008

Ursachen für Drift

Von A Fehlersuche, ACN, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule, Wellenlänge

Der Fall Drift ist je nachdem zwischen lediglich störend und äußerst ärgerlich. Wann ist nun mit Drift zu rechnen? Die Lösung Nachfolgend werden die häufigsten Ursachen genannt: Isokratische Trennungen Die Temperatur ist nicht konstant. Das Problem ist allerdings nur dann wirklich groß, wenn eine merkliche Temperaturdifferenz zwischen Eluent und Säulenraum herrscht Bei einigen Detektoren wie elektrochemischem Detektor oder Brechungsindexdetektor dauert es recht lange, bis die Basislinie stabil ist Die Säule ist (noch) nicht im Gleichgewicht. Bei komplexen Eluenten (z. B. Puffer mit Ionenpaarreagenzien) oder beim Umspülen auf einen „ganz“ anderen Eluenten kann die Gleichgewichtseinstellung recht lang dauern Langsame Elution von…

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7. September 2007

Die „Kleinen“ im Sommer

Von B Optimierung, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Nachweisgrenze, Optimierung, Uncategorized

Alternativen zu Phosphor- und Trifluoressigsäure Bekanntlich werden für den stark sauren Bereich (pH-Wert um 2-2,5) gerne H3PO4 oder TFA verwendet. Der pH-Wert wird häufig nicht eingestellt, auch auf die Verwendung von Puffern wird verzichtet: Eine mögliche kleine Verschiebung des pH-Wertes ist in diesem recht sauren Bereich nicht tragisch, eine merkliche Verschiebung der Retentionszeit wird selten beobachtet. Nun zeigt sich immer wieder, dass nicht nur der pH-Wert – sicherlich der wichtigste Faktor! – sondern auch die verwendete Säure die Selektivität beeinflussen kann. Man sollte bei Optimierungsversuchen im Sauren beispielsweise neben den üblich verwendeten Säuren Phosphor-, Trifluoressig-, Essig-, und Ameisensäure auch an…

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7. Juli 2007

Schnelle Methodenentwicklung in der RP-HPLC

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Sie müssen eine Methode schnell entwickeln und Sie haben wenig Zeit. Selbstverständlich verfügen Sie über eine moderne Gradientenanlage und über ein ansehnliches Säulen-Portfolio. Was wäre nun eine sinnvolle, ökonomische Vorgehensweise, um die Methode wenigstens grob entwickeln zu können? Die Lösung Hardware-Voraussetzung: Sollten Sie über eine Niederdruck-Gradientenanlage mit PDA verfügen, benötigen Sie lediglich ein 6-Säulenschaltventil, imfalle eines Hochdruck-Gradienten zusätzlich ein Eluentenschaltventil. Das Konzept Bekanntlich hängt die Selektivität von der stationären Phase, von dem Eluenten (inkl. Gradient) und von der Temperatur ab, wobei zunächst die zwei Erstgenannten in Frage kommen. Stationäre Phase bedeutet „Chemie“ der Oberfläche (also, polarer/hydrophober Charakter der…

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7. Mai 2007

Wie lange sollte die übliche Equilibrierzeit bei einer RP-Säule sein?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Eine RP-Säule ist häufig zu equilibrieren: Beim „Einfahren“, wenn sie neu ist, beim Umspülen, wenn ein neuer Eluent eingesetzt wird, nach einem Gradientenlauf vor der nächsten Injektion, wenn sie nach getaner Arbeit gelagert wird usw. Wie lange sollte dieser Vorgang nun dauern? Die Lösung Halten wir zunächst folgendes fest: Die Frage sollte weniger lauten „wie lange?“ sondern viel mehr „wie viel Volumen sollte ich über die Säule schicken?“ Beim Einfahren, Um- bzw. Spülen gilt als Faustregel: Ca. 10-15 Säulenvolumina pro Spülschritt bei einfachen Eluenten bzw. üblichen Verunreinigungen und 30-50 Säulenvolumina pro Spülschritt im Falle von komplexeren Eluenten bzw….

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7. April 2005

Von 100% wässriger zu 100% organischer Phase – mögliche Probleme bei Gradientenläufen

Von A Fehlersuche, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Manche AnwenderInnen arbeiten im Gradienten-Modus mit vorgemischten Eluenten, manche legen jeweils 100% A (z. B. Puffer) und 100% B (z. B. ACN) vor und lassen das Gerät die gewünschte Mischung herstellen. Mit nicht-vorgemischten Eluenten kann es zu Problemen kommen, welche wären das und warum? Die Lösung Wenn 100% Puffer und 100% ACN zusammengeführt werden, besteht die Gefahr, dass in dünnen Kapillaren Salze ausfallen (z. B. ab ca. 85% ACN und mehr als 30-30 Mmol Puffer) Wird ein Gradient von 100% A auf 100% B gefahren, herrscht nicht nur der beabsichtigte Lösungsmittelgradient, sondern gleichzeitig ein pH-Wert- und ein Salzgradient….

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7. November 2004

Säulendimensionen und Gradiententrennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Wir haben uns bereits in diesem HPLC-Tipp über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der „Front“ veranlassen mich jedoch ein zweites Mal das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 x 4 mm, Fluss, 1 ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13-14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min x 20 min = 20 ml und 1,5…

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14. Oktober 2003

Säulenlänge, Fluss und Retentionszeiten bei Gradienten-Trennungen

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Hintergrund Wichtig in der HPLC sind „vernünftige“ Wechselwirkungen. So heißt es beispielsweise für isokratische Trennungen: Die interessierenden Komponenten sollten mit einem Retentionsfaktor k, von ca. 2-8 eluieren. Hier haben wir einen sinnvollen Kompromiss zwischen ausreichend starken Wechselwirkungen, robusten Bedingungen und akzeptabler Retentionszeit. Bei Gradienten-Trennungen gilt analog der mittlere Retentionsfaktor : k = mittlerer k-Wert; Analyt befindet sich in der Mitte der Säule (Längsrichtung) tG = Gradientendauer [min] F = Fluss [ml/min] Vm = Säulenvolumen Δ%B = Änderung von B während der Gradientelution S = Steigung der -Kurve; für kleine Moleküle kann für ein Wert von ca. 5 angenommen…

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14. Juni 2003

Schnelle Optimierung einer bestehenden Gradientenmethode

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ich war einmal in einem befreundeten Unternehmen, in dem routinemäßig viele Gradientenmethoden laufen. Nicht alle waren aus Anwendersicht als zufriedenstellend zu bezeichnen. Wir wollten nun schauen, ob eine der häufig eingesetzten Methoden mit einem vertretbaren Aufwand verbessert werden könne, zumal die Anzahl der Proben sehr groß war. Der Versuch war erfolgreich. Ich möchte Ihnen nachfolgend zeigen, wie wir es bewerkstelligt haben, vielleicht können Sie davon profitieren. Die Lösung Abb. 1 stellt die Ausgangssituation dar: „Üblicher“ Methanol/Wasser-Gradient bei 1 ml/min, das Chromatogramm dauerte ohne Spülschritt ca. 16 min. Das war uns für zwei Peaks viel zu lang. Wir haben…

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8. Oktober 2002

Die „Kleinen“ im Sommer

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized

Degasser Ultraschallbad pH-Wert-Verschiebung „sehr“ sauberes Wasser… Spülen Polymere durch das ACN Isokratische vs. Gradiententrennungen   Verfügen Sie nicht über einen Degasser und ist Ihnen Helium zu teuer, verwenden Sie einfach (sauberen!) Stickstoff. Er ist billig und leistet tolle Entgasungs-Dienste. Ein kleines Problemchen kann allerdings dabei auftauchen: Manche Pumpe „verschluckt“ sich etwas häufiger Ein Ultraschallbad ist bekanntlich als Entgasungs-Tool alleine recht uneffektiv. Es hat sich jedoch gezeigt, dass bei gepufferten Eluenten eine etwa 5-min Entgasung nach einer Vakuum-Filtration zu einer besseren Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten führt. Offensichtlich wird durch diese Prozedur eine gleichbleibende CO2-Konzentration und damit ein konstanter pH-Wert des Eluenten erreicht….

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9. Juli 2002