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HPLC-Tipps

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Konstante Retentionszeiten bei Verkleinerung des Säulendurchmessers – so klappt es!

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodentransfer

Der Fall Eine Verkleinerung des Innendurchmessers bringt zwei handfeste Vorteile mit sich: Verbesserung der Massenempfindlichkeit und Einsparung von Lösungsmitteln. Angenommen, Sie ändern nur den Innendurchmesser der Säule, die restlichen chromatographischen Bedingungen wie stationäre Phase, Eluent, Temperatur usw. bleiben gleich. Wie sollte nun der Fluss sein, damit die Retentionszeiten konstant bleiben? Die Lösung Mit Hilfe folgender Formel können Sie die gesuchte Flussrate errechnen: F1: ursprünglicher Fluss [ml/min] ID1: ursprünglicher Innendurchmesser [mm] F2: neuer Fluss [ml/min] ID2: neuer Innendurchmesser [mm] Stellen Sie die so errechnete Flussrate ein, haben Sie in beiden Fällen die gleiche lineare Geschwindigkeit [cm/sec], die Retentionszeiten bleiben weitestgehend konstant….

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14. September 1997

Der Elefant, der Streitsüchtige, der Enthaltsame und der Gesellige oder: Peaks vor der Front?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit

Der Fall Wir wissen alle, was die Totzeit, t0 , (Front, Frontpeak, Durchbruchzeit, Mobilzeit, Lösungsmittelpeak, „Luftpeak“) bedeutet: Das ist die Aufenthaltszeit einer Substanz im Eluenten. Also die Zeit, die eine Substanz benötigt, um vom Injektionspunkt bis zum Detektor zu gelangen  – falls die Substanz nicht an der stationären Phase „hängen“ bleibt: Eine solche Komponente verhält sich im gegebenen chromatographischen System inert. Das ist logischerweise gleichzeitig die Elutionszeit für ein Eluentenmolekül. Konsequenterweise dürfte keine Substanz vor t0 eluieren, sie kann ja nicht schneller sein, als z. B. ein Methanolmolekül – oder doch? Die Lösung Ja, Peaks vor der Front sind in der…

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15. August 1997

Zusätze im Eluenten

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Bei der Herstellung von Eluenten werden immer wieder bestimmte Zusätze (Additiva, „Modifier“) verwendet. Das sind kleine Mengen bestimmter Substanzen – in der Regel im Promille- oder im unteren Prozentbereich -, die einem meist binären Eluenten zugesetzt werden. Wann ist dies notwendig und was bewirken diese Zusätze? Die Lösung Die HPLC-Trickkiste ist unerschöpflich. Die Hauptziele dabei sind: eine bessere Peakform und eine Änderung der Selektivität. Nachfolgend finden Sie in tabellarischer Form für häufige Anwendungen bewährte Zusätze. Häufige Zusätze im Eluenten Das Fazit Kleine Zusätze haben oft eine große Wirkung. In Hinsicht auf Robustheit beachten Sie bitte jedoch folgendes: Nach…

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8. Juli 1997

Algen, Pilze und Bakterien in der HPLC

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Sobald Wasser und insbesondere Pufferlösungen stehen gelassen werden, besteht die Gefahr, dass Mikroorganismen wachsen. Ergebnis: Erhöhter Druck, Geisterpeaks, „Buckel“. Wie verhindert man deren Wachstum und wie wird bei Bedarf dieser Mini-botanischer Garten zum Verlassen der Anlage bewegt? Die Lösung In folgenden Situationen fühlt sich manches Tierchen und Pflänzchen wohl: Ruhendes Gewässer, sonnige Plätzchen, gemütliche Ecken – am besten mit Versteckmöglichkeiten, unebenes Gelände, was bedeutet: Stehender Eluent, Tageslicht (z. B. Pufferlösung auf der Fensterbank), Fritten, Fittings, Mischkammer sind ausreichend vorhanden, rauhe, schmutzige Oberflächen in der Anlage. Für Speise und Trank ist bestens gesorgt, was bedeutet: Es werden Pufferlösungen serviert …

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10. Juni 1997

Trennung einer unbekannten Probe in einem RP-­C18-System – wie gehe ich vor?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, Säulenauswahl

Der Fall Nehmen wir an, Sie möchten eine mehr oder weniger unbekannte Probe in einem RP-C18-Sy­stem chromatographieren. Wie sollen Sie nun das chromatographische System aussuchen? Betrachten wir das Ganze aus einem etwas anderen Blickwinkel als in diesem HPLC-Tipp. Die Lösung Nachfolgend erholten Sie einen groben Grund-­Leitfaden, der  – je nach individuellen Gegeben­heiten  – weiter „verfeinert“ werden kann. 1. Grundvoraussetzungen Probe im Eluenten (H2O/MeOH bzw. H2O/ ACN) wenigstens teilweise löslich Molekulargewicht für isokratische Trennungen vorzugsweise bis ca. 400-500. Molekulargewicht für Gradiententrennungen bis ca. 2000-3000. Wenn das Molekularge­wicht unbekannt ist, bedienen Sie sich folgen­den Tricks: Elution vor t0 (Totzeit) bedeutet, dass die Probe ausgeschlossen…

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8. Mai 1997

Die Nitrilphase – manche mögen es polar.

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Für viele Anwender sind restliche RP-Phasen außer den gewohnten C18 oder C8 exotisch. Sind sie auch. Die Nitril- oder Cyanophase ist eine solche polare Phase. Wann wäre ihr Einsatz nun sinnvoll (siehe auch diesen HPLC-Tipp)? Die Lösung Die Nitrilphase hat sowohl eine polare als auch eine apolare Funktionalität: Die CN-Gruppe ist für den polaren, die Propylgruppe (der Tracer zwischen der CN-Gruppe und der Kieselgeloberfläche) für den apolaren Charakter zuständig. Somit steht CN bezüglich Polarität zwischen beispielsweise einer Aminophase und Kieselgel. Das bedeutet: Wenn bestimmte apolare Komponenten zu stark mit C18 oder C8 wechselwirken (unangenehm lange Retentionszeiten), wäre an…

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5. April 1997

Wo kommt ein Geisterpeak her?

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Der Fall Geister trifft man selten im Labor an – obwohl ich dem Verdacht nicht loswerde, dass sie dort doch des öfteren ihr Unwesen treiben… Geisterpeaks dagegen sind, leider Gottes, ganz quicklebendige Erscheinungen. Was sind Geisterpeaks? Das sind Peaks, die ganz unerwartet in dem Chromatogramm erscheinen. Wo kommen sie nun her und wie kann man deren Herkunft einreihen? (siehe auch diesen HPLC-Tipp). Die Lösung Die häufigsten Ursachen für Geisterpeaks sind: Verunreinigungen aus dem Eluenten, überschüssiges Ionenpaarreagenz usw. spät eluierende Substanzen Memoryeffekt durch Desorption einer Substanz aus der stationären Phase, aus einer Dichtung, einem Fitting, einer Fritte etc. Luftblasen im Detektor Zersetzungsprodukte…

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9. März 1997

Spikes im Chromatogramm

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ihre Chromatogramme sehen recht anständig aus, doch ärgern Sie sich immer wieder über auftretende Spikes. Dies sind kleinere oder größere Striche, die häufig an verschiedenen Stellen im Chromatogramm erscheinen. Welche Ursachen können dafür verantwortlich sein und was kann man dagegen tun? Die Lösung Die Hauptursachen für Spikes sind: Luftblasen, Detektor, Elektronik, „Sonstiges“. Schauen wir uns die einzelnen Ursachen etwas genauer an. Luftblasen Einfacher Beweis für Luftblasen in der Pumpe (Δ tR): Wenn Sie die Pumpe ausschalten, sind auch die Spikes weg. Luftblasen im Detektor (Luftbläschen aus dem Eluenten direkt nach der Säule, „Ausgasen“) ergeben eine „unmögliche“ Basislinie, die…

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9. Februar 1997

Wie optimiere ich eine Gradiententrennung?

Von B Optimierung, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Eine Gradiententrennung ist am effektivsten über das Gradientenprofil, die Steigung des Gradienten und das Gradientenvolumen zu optimieren. Eine gewünschte Auflösung in kurzer Zeit ist oft erst nach Verlassen der üblichen linearen Gradienten zu erreichen. Denken Sie daher auch an konvexe, konkave oder zusammengesetzte lineare Gradientenkurven mit isokratischen Stufen dazwischen – allerdings: Steht Methodentransfer ins Haus würde ich bei linearen Gradienten bleiben. Zum Herausfinden eines optimalen Gradienten leisten Optimierungsprogramme wie z. B. DryLab, Fusion QbD und ChromSword wertvolle Hilfestellung. Die zweite Optimierungsmöglichkeit ist die Änderung des Gradientenvolumens. Schauen wir uns diese zweite Möglichkeit an, ist sie doch auch ohne…

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21. Januar 1997

Ist der linke oder der rechte Pumpenkopf defekt?

Von A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Pumpe

Der Fall Die Ein- und Auslassventile sind die Schwachpunkte Nr. l jeder HPLC-Pumpe. Wenn Sie nun Flussschwankungen festgestellt und Luft als Ursache ausgeschlossen haben, bleibt Ihnen nichts anderes übrig, als in den sauren Apfel zu beißen und den Pumpen­kopf auseinanderzubauen (lassen). Viele der HPLC-Pumpen sind heute Doppelkolbenpumpen. Die Frage ist also, welcher Kopf muss ausgebaut werden, der linke oder der rechte? Zudem ist nun das Einlass- oder das Auslassventil verschmutzt? Eine 25%ige Chance, das richtige Teil auszubauen, ist zwar nicht schlecht, doch könnten Sie auch folgen­den Trick anwenden, um die Trefferquote zu erhöhen. Die Lösung Man saugt eine Luftblase von…

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29. Dezember 1996