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HPLC-Tipps

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Die „Kleinen“ im Sommer …

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Methodentransfer, polare Komponenten, Uncategorized

„Was sollte ich denn machen, die hatten nur Vodka…“ Folgende Anekdote eines Kollegen aus den Anfängen der HPLC: Er war um 1980 herum in der Sowjetunion auf Kundenreise. Im tiefsten Sibirien angekommen, wollte er nach einem Kundengespräch als Beleg für das Besprochene auch ein paar praktische Versuche durchführen – manch einer war logischerweise etwas misstrauisch gegenüber Versprechungen aus dem Westen… Damals war es mit dem Zoll noch schwieriger als heute, er konnte gerade zwei Säulen dabei haben, es waren je eine 25 cm lange Spherisorb C8 bzw. Spherisorb CN. Mit MeOH und ACN war natürlich „nichts“, aber Vodka, davon war…

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16. Juni 2016

Kommen die Peaks früher, wird die Trennung wohl schlechter – oder?

Von Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Es gibt in der HPLC mehrere Möglichkeiten, die Peaks nach vorne zu schieben. Dabei rücken sie zusammen, die Auflösung nimmt natürlich ab. So lautet eine (vor)schnelle Schlussfolgerung. Das stimmt allerdings nicht immer. Wann nicht und warum? Die Lösung Betrachten wir hier ein klassisches RP-System. Ich kann die Wechselwirkungen zwischen Analyten und stationärer Phase wie folgt verringern, die Peaks eluieren dabei früher: Den organischen Anteil der mobilen Phase bzw. die Temperatur erhöhen, den pH-Wert verändern, schließlich kann ich eine polarere stationäre Phase verwenden. Wenn meine Substanzen nun sich chemisch ähneln und dementsprechend auch chromatographisch ähnlich verhalten – man spricht…

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16. Mai 2016

Modernes HPLC/UHPLC gekauft, dennoch unzufrieden – warum? II

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Methodentransfer, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall In diesem Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass an einem modernen HPLC/UHPLC-Gerät Peakform, Auflösung und Empfindlichkeit im Vergleich zu einem älteren Gerät womöglich zu wünschen übrig lassen. Heute wollen wir mögliche Gründe für die zwei letztgenannten Fälle ausfindig machen. Die Lösung Schlechtere Trennung an modernen Geräten Moderne HPLC/UHPLC-Geräte weisen im Vergleich zu älteren Geräten ein wesentlich kleineres Verweilvolumen auf, Verweilvolumen = Dwell- oder Delayvolume: Volumen von der Mischkammer/dem Mischventil bis zum Säulenkopf. Das Verweilvolumen wiederum beeinflusst beim Gradienten u.a. auch die Auflösung nach dem Motto: Δ Verweilvolumen oft Δ Auflösung. Und hier liegt der „Hund begraben“: Kleines…

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16. April 2016

Modernes HPLC/UHPLC gekauft, dennoch unzufrieden – warum? I

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Methodentransfer, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Sie haben ein modernes HPLC- oder gar ein recht teures UHPLC-Gerät gekauft. Voller Freude sind Sie auf die ersten tollen Ergebnissen gespannt. Dann die große Enttäuschung: Ihre Peaks zeigen ein Fronting, die Auflösung ist schlechter als an Ihrer alten „Kiste“ und/oder die Peaks sind wesentlich kleiner als sonst. Dass das Gerät qualifiziert wurde und demnach keine technischen Probleme vorliegen, ist völlig klar. Was ist los? Die Lösung Lasst uns jedes Problem, das ich weiter oben genannt habe, separat behandeln. Betrachten wir hier das Fronting und in diesem HPLC-Tipp widmen wir uns dann der schlechteren Auflösung und dem Empfindlichkeitsverlust….

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16. März 2016

Peaky und Chromy kurz vor Jahresende – die richtigen Antworten zum „Lügenbuch“ von Peaky

Von HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky ist dabei, ein HPLC-„Lügenbuch“ zu verfassen. Welche der nachfolgenden Aussagen sind richtig und welche nicht? Hier die Antworten (Hier geht es zu der Ausgangssituation): „Bald wird es HPLC-Säulen aus dem 3D-Drucker geben, dadurch erscheinen 1.000.000 Böden keine Utopie mehr“Nicht unbedingt eine Lüge, Erläuterung: „Getrennt wie gedruckt“ könnte demnächst Realität werden: Es wird damit gerechnet, dass HPLC-Säulen in absehbarer Zeit auf breitet Basis und nicht wie im Moment vereinzelt mithilfe der 3D-Drucker-Technologie „gedruckt“ werden. Durch eine nahezu identische Größe von ≤ 1,5 µm-Teilchen (engste Korngrößenverteilung), deren perfekten Anordnung in der Säule sowie einer nahezu perfekten Säulenhardware wären 1.000.000 Böden keine…

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16. Januar 2016

Peaky und Chromy kurz vor Jahresende…

Von HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaks am Feierabend: Chromy, der Gemütliche, genießt seinen Cognac – und die ruhige Zeit vor Weihnachten. Peaky, der seltenst ruhig auf seinem Allerwertesten sitzen kann, marschiert aufgeregt hin und her. Nach einer gewissen Zeit wird sogar Chromy neugierig und fragt mit seiner tiefen, behäbigen Stimme: „Was machst Du denn da eigentlich? Peaky wie aus der Pistole: „Siehst du doch, mir geht´s nicht gut, gar nicht gut, entsetzlich geht´s mir“. „Ja, was hast du denn?“ „Guck´, ich will ein Buch schreiben, ein Lügenbuch; ein Buch, das möglichst viele, viele, viele Lügen enthält. Ich hab´ schon damit angefangen und auch einiges überlegt,…

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16. Dezember 2015

Generische Gradienten in der RP-HPLC II

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall In diesem Tipp hatte ich Ihnen einige Faustregeln und Erfahrungswerte vorgestellt, mit deren Hilfe man eigene, der Fragestellung passend generische Gradienten entwickeln kann. Hier möchte ich Ihnen einige Beispiele zeigen, bei Bedarf folgt eine kurze Erläuterung. Diese Chromatogramme stammen im Wesentlichen aus umfangreichen Untersuchungen, die Hans-Joachim Kuss durchgeführt hat. Die Lösung Die ausgesuchten Beispiele befassen sich mit den Fragen „Start % B“ und „Steilheit“ Die oft angewandte Praxis, mit „viel“ Prozent Wasser/Puffer zu starten, ist selten zweckdienlich, denn: Ein Starten mit hohem wässrigen Anteil führt dazu, dass alle Peaks auf der stationären Phase quasi „festgehalten“ und im Chromatogramm…

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16. November 2015

Generische Gradienten in der RP-HPLC I

Von B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel

Der Fall Gradientelution ist den Königsweg bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe in der RP-HPLC. Ein Gradientenlauf ist ferner der erste – und mangels Zeit oft auch der einzige – Schritt, wenn es um eine schnelle Information geht, so beispielsweise bei der Reaktionskontrolle. Vielerorts haben sich nun sogenannte generische Gradienten etabliert: Ein generischer Gradient ist ein Gradient, der sich für meine, immer wieder zu analysierenden, recht ähnliche Substanzen und meine Zielsetzung als geeignet erwiesen hat. So ist beispielsweise „0,1-0,05% TFA/ACN“ für viele Fragenstellungen ein bewährter Gradient. Über solche Gradienten und Faustregeln, die sich in der Praxis als praktikabel erwiesen haben,…

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16. Oktober 2015

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Uncategorized

Peakfläche und Injektion, Spülen von RP-Säulen Mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche (hier: Injektor) Weitgehend bekannte Ursachen wie Leckage, Luft in der Spritze, verstopftes Nadelloch durch Dichtungsmaterial/Septumpartikelchen/Salz etc. lassen wir heute außer Acht, ich würde gerne eher auf Sachen eingehen, an die man vielleicht nicht sofort denkt. Nachfolgend stichwortartig einige Ideen und Denkanstöße. Erstes großes Thema: Memory-Effekt durch Physisorption bestimmter Analyte an unterschiedlichen Oberflächen. Merke: Die Affinität gegenüber Oberflächen hängt nicht nur vom Material der Oberfläche selbst, sondern auch von den chromatographischen Bedingungen ab. Unterschiedliches Material der Kapillare (Peek vs. Stahl) Unterschiedliches Material der Nadel (Stahl vs. Messing vs. Titan vs. Peek vs. Keramik) auch…

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13. September 2015

Die „Kleinen“ im Sommer

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Schauen wir uns die in diesem Tipp beschriebenen Fälle an: Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (II)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Peakfläche und konzentrationsabhängiger Detektor 1. Nehmen wir an, am Eingang zum Detektor tritt eine Leckage auf und ein Teil der Probe geht dadurch verloren. In…

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16. Juli 2015