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Methodenentwicklung -Transfer und -Optimierung Archive - Dr. Stavros Kromidas

Benutze deine UHPLC in diesen Fällen lieber nicht als UHPLC…

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Die LC-Anlage von heute ist eine UHPLC. Die UHPLC hat zweifelsohne Vorteile; so sind beispielsweise Anwender zufrieden ob der kurzen Läufe, der „guten“ Trennungen und des geringen Lösemittelverbrauchs. Möchte man nun seine UHPLC wirklich unter UHPLC-Bedingungen betreiben (z. B. 100 mm, 2,1 mm, ≤ 2 µm, Druck ≥ 700-800 bar) so gibt es Fälle, in denen man es lieber nicht machen sollte. Tut man es doch, so sind Probleme zwangsläufig vorprogrammiert. Welche Fälle wären das? Die Lösung Es gibt eine Reihe von Situationen, in denen Trennungen unter HPLC-Bedingungen sinnvoller als unter UHPLC-Bedingungen sind. Ich greife willkürlich vier Fälle…

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20. Mai 2014

Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen (2)

Von Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Ca. 70-80% der RP-Trennungen in der Routine sind Gradientenläufe. Den meisten Anwendern sind die Vorteile der Gradientelution geläufig, so z. B: Trennung von polaren und apolaren Komponenten in einem Lauf, merklich kürzere Trenndauer im Vergleich zu isokratischen Läufen, Erniedrigung der Bestimmungsgrenze und nicht zuletzt: Ein Übersichtsgradient ist ein hervorragender erster Schritt bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe. Was ist nun bei Gradiententrennungen grundsätzlich „anders“ im Vergleich zu isokratischen Trennungen? Die Lösung Isokratische und Gradiententrennungen stellen zwar keine gänzlich andere Welten dar, gibt es doch einige entscheidende Unterschiede. Nachfolgend greife ich stellvertretend zwei Unterschiede heraus. Interessierten Lesern sei auf…

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20. März 2014

Die wichtigsten Änderungen in der USP zur HPLC (2)

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Im diesem HPLC-Tipp habe ich Ihnen einige aktuelle Vorgaben in der USP vorgestellt und bin auf den Systemeignungstest eingegangen. Hier geht es kurz um die Vorsäule und ich werde darüber hinaus Hinweise, Definitionen und Empfehlungen in dem USP-Text kommentieren. Vorsäule Auch wenn in einer Monographie-Methode keine Vorsäule angegeben wird, ist die Verwendung einer solchen unter folgenden zwei Bedingungen erlaubt: Länge: Vorsäule nicht länger als 15% der analytischen Säule  „same bonded phase (e.g., C18)”; in dieser Leseart bedeutet es, dass ein anderes C18-Füllmaterial, als in der analytischen Säule enthalten, verwendet werden darf, z. B. eines mit einer größeren spezifischen…

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25. August 2012

Die wichtigsten Änderungen in der USP zur HPLC (1)

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall In der Pharma werden vielfach Monographie-Methoden verwendet, somit sind für die Anwender dort Vorgaben der europäischen und der US-Pharmakopöe von Relevanz. Das Kapitel 621 zur Chromatographie in der USP wird immer wieder überarbeitet. Ich werde in diesem sowie in diesem HPLC-Tipp einige Änderungen vorstellen. Sollte für Sie das Thema von Relevanz sein, sollten Sie sich periodisch bzgl. Revisionen im Netz erkundigen. Hier werde ich auf den Systemeignungstest eingehen. Damit Sie ein komplettes Bild erhalten, werde ich in dieser Kurzübersicht auch jene wichtigen Vorgaben erwähnen, die unverändert geblieben sind. In diesem HPLC-Tipp geht es dann kurz um die Vorsäule…

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25. Juli 2012

Unterschiede zwischen isokratischen und Gradiententrennungen (1)

Von Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Lösungsmittel, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Wir wissen alle, was der Unterschied zwischen isokratischen und Gradientrennungen ist: Bei isokratischen Trennungen bleibt die Zusammensetzung des Eluenten während der Gesamttrennung konstant, bei Gradiententrennungen erhöht sich permanent die Elutionsstärke; so nimmt beispielsweise bei RP-Trennungen vom Anfang bis Ende des Laufs der MeOH- bzw. ACN-Anteil der mobilen Phase zu – die Wechselwirkungen zwischen Eluent und stationärer Phase nehmen ebenfalls zu – und die Peaks werden nach vorne „geschoben“. So weit so gut. Wo liegen nun aus praktischer Sicht die Unterschiede zwischen beiden Trennmodi? Die Lösung Der Unterschiede gibt es zu Genüge, nachfolgend die Wichtigsten inkl. kurzer Kommentierung: Peakform…

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25. Mai 2012

Die Vorsäule – nicht nur als „Vorsäule“ zu nutzen…

Von B Optimierung, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Säule, Veränderung der Peakfläche, Vorsäule

Der Fall Mit einigen Anwendern habe ich vor Ort ein Paar einfache Optimierungsexperimente durchgeführt. Wir haben einiges ausprobiert, nachfolgend werden 1-2 Ergebnisse vorgestellt. Uns ging es vor allem um die Frage: Was ist mit einfachen Mitteln möglich und was „bringt“ wann, was? Die Lösung Vorbemerkung: In den Abbildungen weiter unten werden Chromatogramm-Ausschnitte aus längeren Läufen gezeigt. Man betrachte Abb. 1. Es handelt sich um die Injektion von 50 µl einer recht komplexen Probe (Linearer Puffer/ACN-Gradient, Fluss: 1,6 ml/min, Kromasil C18, 5µm). Abb. 1 Injektion einer 50 µl Probe bei F=1,6 ml/min, Details, siehe Text Im vorliegenden Fall interessiert am meisten…

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26. Mai 2011

Wenn „UHPLC“ als UHPLC genutzt werden soll…

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Seit Einführung der UPLC von Waters im Jahre 2004 haben mehrere Anbieter nachgezogen, in der Zwischenzeit wird eine ganze Reihe von UHPLC-Systemen angeboten. Diese Geräte machen den Großteil der Neukäufe aus. Die Erfahrungen sind durchaus positiv, man sollte sich jedoch einige Sachen bewusst machen. Die Lösung Manchmal werden UHPLC-Geräte lediglich zur Verkürzung der Analysenzeit von alten Methoden benutzt. Beispielsweise wird aus einem alten 20-30 min-Lauf mit 5-10 Peaks mithilfe der UHPLC ein 5-8 min-Lauf. Wenn dies in etwa das avisierte Ziel war und man damit zufrieden ist, ist alles OK, der Methodentransfer HPLC-UHPLC sollte funktionieren und im Alltag…

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29. Oktober 2009

Wie kann die Bodenzahl erhöht werden?

Von Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Halten wir zunächst folgendes fest: Eine Erhöhung der Selektivität stellt mit Abstand die effektivste Maßnahme dar, um die Auflösung zu verbessern. Folglich sollte diesem Schritt als erstem die ganze Aufmerksamkeit zu Beginn einer Methodenoptimierung geschenkt werden. Wenn jedoch eine Verbesserung der Selektivität mit einem vertretbaren Aufwand nicht zu erzielen ist, wäre die Erhöhung der Bodenzahl der zweitbeste Weg. Welche Möglichkeiten gibt es nun, dies zu erreichen und welche Maßnahme „bringt“ wie viel? Die Lösung In Abb. 1 sind die Möglichkeiten zusammengefasst, die zu einer Erhöhung der Bodenzahl führen. Symbol-Erklärung: N: Bodenzahl R: Auflösung („Resolution“) S/N: Peak/Rausch-Verhältnis („Signal to…

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29. April 2009

Unterschiede von HPLC- und UPLC/UHPLC-Trennungen

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Seit Anfang der 2000er (Waters 2004) Jahren werden UHPLC-Geräte eingesetzt. Man könnte nun vereinfacht annehmen, es handele sich dabei um „normale“ HPLC-Geräte, die lediglich so konzipiert sind, dass sie eben hohe Drücke ermöglichen. Das Ergebnis lautet: Merkliche Reduktion der Analysenzeit und des Lösungsmittelverbrauchs, sowie – wegen der kleinen verwendeten Teilchen und der damit verbundenen hohen Bodenzahlen – Verbesserung der Auflösung. Zweifelsohne sind dies aus Anwendersicht die wichtigsten Unterschiede/Vorteile gegenüber klassischen HPLC-Trennungen. Beim Methodentransfer jedoch von HPLC- auf UHPLC-Trennungen sollte man auch an manch eine Besonderheit der UHPLC denken. Damit meine ich nicht bekannte Tatsachen wie peinliche Vermeidung von…

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7. Mai 2008

Schnelle Methodenentwicklung in der RP-HPLC

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Sie müssen eine Methode schnell entwickeln und Sie haben wenig Zeit. Selbstverständlich verfügen Sie über eine moderne Gradientenanlage und über ein ansehnliches Säulen-Portfolio. Was wäre nun eine sinnvolle, ökonomische Vorgehensweise, um die Methode wenigstens grob entwickeln zu können? Die Lösung Hardware-Voraussetzung: Sollten Sie über eine Niederdruck-Gradientenanlage mit PDA verfügen, benötigen Sie lediglich ein 6-Säulenschaltventil, imfalle eines Hochdruck-Gradienten zusätzlich ein Eluentenschaltventil. Das Konzept Bekanntlich hängt die Selektivität von der stationären Phase, von dem Eluenten (inkl. Gradient) und von der Temperatur ab, wobei zunächst die zwei Erstgenannten in Frage kommen. Stationäre Phase bedeutet „Chemie“ der Oberfläche (also, polarer/hydrophober Charakter der…

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7. Mai 2007