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Optimierung Archive - Seite 3 von 4 - Dr. Stavros Kromidas

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Integration, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Variationskoeffizient (Vk)

Der Fall In diesem Peak haben wir uns mit physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigt, die beim Methodentransfer zu unterschiedlichen Flächen (und somit zu unterschiedlichen Gehalten) führen  – trotz technisch einwandfreier Hardware. Hier geht es um Probleme bei der Anwendung der Methode, einmal durch unterschiedliche Zahlenwerte innerhalb der Spezifikationsanforderungen und einmal durch Unterschiede bei den Einstellparametern, sowohl was die Datenaufnahme als auch die Integration betrifft. 1. Spezifikationsanforderungen Betrachten wir als Beispiel folgende Anforderungen in einer Prüfvorschrift: „ pH-Wert des Eluenten 4,5 +/- 0,1 pH-Einheiten, Tailingfaktor des Hauptpeaks kleiner/gleich 1,3, Auflösung R zwischen Hauptpeak und Verunreinigung größer/gleich 1,5“. Im Extremfall – aber immer noch innerhalb…

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7. März 2008

Auswertung über die Peakfläche oder über die Peakhöhe?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Integration, Veränderung der Peakfläche

Der Fall In nahezu jedem Regelwerk wird „expressis verbis“ vermerkt, dass die Auswertung sowohl über die Peakfläche als auch über die Peakhöhe erfolgen kann. Dennoch hat sich in der Praxis bis auf wenigen Ausnahmen die Auswertung über die Peakfläche etabliert. Ich bin Realist genug zu wissen, dass sich diesbezüglich kaum etwas grundsätzliches ändern wird. Es lohnt sich allerdings schon, sich einigen Fakten bewusst zu machen. Die Lösung Zur Vorbereitung für ein Buch über Integration und Auswertung (1) haben wir uns intensiv mit dem Thema „Integration“ auseinandergesetzt. Hans-Joachim Kuss und Mike Hillebrand haben mehrere Software auf ihre Fähigkeit zur „richtigen“ Integration…

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7. Januar 2008

Eine/mehrere polare Komponente(n) eluiert(en) direkt an der Totzeit – was tun?

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule

Der Fall Nehmen wir an, Sie können Ihre viele, mehr oder weniger apolare Komponenten recht gut trennen. Nur eine oder zwei Komponente(n) bereitet(n) Ihnen Kopfzerbrechen: Jene polare eluiert(en) direkt beim Totzeitpeak bzw. an der Flanke des an der Totzeit eluierenden polaren „Drecks“. Wie auch immer, gestaltet sich deren Integration als wahres Abenteuer. Wenn Sie nun großartig Gradient, Säule usw. ändern würden, mit dem Ziel diese(n) polare(n) Peak(s) nach hinten zu verschieben, könnte es sein, dass womöglich die Trennung restlicher Peaks sich ändert/verschlechtert und dazu haben Sie logischerweise keine Lust. Was tun? Die Lösung Bauen Sie vor Ihre C18-Säule eine kurze…

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7. November 2007

Legale Tricks, um eine geforderte Bodenzahl doch noch zu erreichen

Von B Optimierung, Bodenzahl, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Totvolumen

Der Fall Nehmen wir an, dass eine der Forderungen in der Prüfvorschrift einer Routine-Methode lautet: „Bodenzahl für Peak X mindestens 5.000“. Dass ich der Meinung bin, dass eine derartige Forderung unnötig ist, bringt nichts zur Sache, lassen Sie mich dennoch diese These kurz erläutern: Bei einer Trenntechnik wie der HPLC geht es ja um Trennung und das wichtigste – um nicht zu sagen das ausschließliche – Kriterium für eine ausrechende Trennung ist die Auflösung (Auflösung, vereinfacht: Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis). Wenn ich nun die geforderte Auflösung von beispielsweise 1,3 oder 1,5 erreiche, bedeutet dies, dass ich in…

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7. Januar 2006

LC-MS-Kopplung – Matrix-Einfluss, das Problem der Empfindlichkeit

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

Der Fall Die LC-MS-Kopplung wird naturgemäß – abgesehen von Spezialfällen wie z. B. LC-MS als „Peakseparator“ für Fraktionierungen in der präparativen HPLC – zur Überprüfung der Peakhomogenität und zur Substanzidentifizierung eingesetzt. Dies geschieht häufig im Spurenbereich, z. B. Zersetzungs- und Nebenprodukte, Metabolite, unbekannte Verunreinigungen (Target/Non-Target-Analytik). In solchen Fällen gilt, jeglichen Verlust an Empfindlichkeit zu vermeiden. Welche Möglichkeiten gibt es nun dafür? Die Lösung Nachfolgend sind einige Hinweise stichwortartig aufgelistet. Matrix Überprüfen Sie eine evtl. Ionisationsunterdrückung durch die Matrix: Eine Standardlösung wird mit Hilfe einer zweiten Pumpe und eines T-Stückes dem Eluenten nach der Säule zudosiert. Nachdem die Basislinie konstant ist,…

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7. September 2004

Muss es eigentlich immer HPLC sein?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung

Manche(r) fragt sich: „Was soll das für eine komische Frage und gar als HPLC-Tipp?“ Na ja, schauen wir mal. Der Fall Sie bestimmen den Gehalt eines Wirkstoffs, beispielsweise aus einer Tablette oder nach einer Freisetzung. Oder Ihre Aufgabe besteht darin zu überprüfen, ob der Kessel vor der nächsten Produktionscharge wirklich sauber ist (Reinigungsvalidierung). Wie auch immer, Sie erhalten einen einzigen Peak. Sie verwenden also eine kurze Säule, sagen wir 50 mm, das Chromatogramm dauert nicht lange, sagen wir 6 min. Wenn alles gut läuft und Sie sonst zufrieden sind, dann besteht in der Tat kein Handlungsbedarf. Sie brauchen nicht weiter…

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15. September 2003

Erniedrigung der Nachweisgrenze durch Optimierung der Injektion

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Nachweisgrenze, Optimierung

Der Fall Die Verbesserung der Peakform ist in der Spurenanalytik (Reinheit, Stabilitäts- und Toxizitäts-Untersuchungen, Reinigungsvalidierung, Umweltanalytik) wichtiger als sonstwo. Denn wenn ich bei konstant injizierter Menge – und damit gleicher Fläche – einen scharfen und damit höheren Peak erhalte, ist die Quantifizierung mit einem kleineren Fehler behaftet. Es existieren einige bewährte Maßnahmen, die zu schmalen Peaks führen, z. B. dünnere Säulen, kleinere Teilchen, Erniedrigung des Totvolumens der Apparatur, Optimierung der Detektion, Verbesserung der Kinetik (Temperatur, Modifier) usw. Heute werden wir uns mit ein paar einfachen Tricks beim Injizieren beschäftigen. Die Lösung Es gibt zwei Ansätze: 1.) Verdünnung der Substanzzone verhindern…

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14. November 2000

Die richtige Wellenlänge – „es ist eine alte Geschicht´, doch bleibt sie immer neu“

Von B Optimierung, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Wellenlänge

Der Fall Ich habe wirklich lange mit mir selber gerungen, ob ich diese Trivialität als „HPLC-Tipp“ schreiben soll. Nachdem ich mich jedoch vor kurzem einen halben Tag „dumm und dämlich“ nach verlorenen Peaks gesucht habe und ich sämtliche mir bekannte griechische, deutsche und saarländische Schimpfworte losgeworden bin, wage ich es doch. Meine Lehre daraus ist: Fangen Sie bitte an, eine Trennung zu optimieren oder nach einem Fehler zu suchen erst dann, wenn Sie 100 % sicher sind, dass die eingestellte Wellenlänge optimal beziehungsweise richtig ist. Übertreibe ich vielleicht ein bisschen? Die Lösung Ich denke nein, es sei denn, Sie sind…

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15. August 2000

Einstellparameter einer HPLC-Apparatur

Von B Optimierung, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration

Der Fall Die Einstellparameter eines analytischen Instruments sind wichtig, das ist sicherlich geläufig. Dennoch mache ich die Erfahrung, dass jene leider nicht immer den Applikations-relevanten optimalen Wert haben. Das ist schade, denn häufig führen solche legale „Manipulationen“ zu ausreichender Auflösung ohne z. B. Säule oder Eluent wechseln zu müssen. Um welche Einstellungen geht es konkret? Die Lösung Ich denke, wir können auf das Eingeben von selbstverständlichen Parametern  wie z.B. Fluss, Temperatur oder Injektionsvolumen verzichten. Nachfolgend eine kurze Übersicht über einige Parameter der „zweiten“ Reihe. Zu jedem Punkt der Tabelle gibt es schöne Beispiele, greifen wir hier die Zeitkonstante („time constant“,…

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14. Juli 2000

Miniaturisierung ja – aber was ist in der Routine wirklich machbar und sinnvoll?

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Peakverbreiterung, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Miniaturisierung ist aus wirtschaftlichen und analytischen Gründen häufig ein vernünftiger Ansatz. Was ist nun mit einem „normalen“ Gerät machbar und wann lohnt es sich? Die Lösung Vorbemerkung Für folgende Fälle kann ich die Skepsis mancher Kollegen gegenüber Miniaturisierung nachvollziehen und teilweise sogar teilen: Stark regulierte Umgebung, matrixbelastete Proben und/oder große Anzahl an Komponenten, keine HPLC-Spezialisten in Routine-/Betriebslabors, knappe Zeit, um auftretenden Fehlern nachzugehen, usw.. Das bedeutet keinesfalls, dass in solchen Fällen Miniaturisierung nicht sinnvoll ist, es heißt nur, dass vor einer „Ja/Nein“-Entscheidung eine nüchterne Analyse mit objektiven und belegbaren Vor-/Nachteilen unabdingbar ist, z. B: Was gewinne ich an…

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14. Dezember 1999