Temperatur-Änderung – einige Konsequenzen „Funktionierendes“ Gerät – unterschiedliche Ergebnisse Temperatur Passend zur Jahreszeit hier ein Hinweis bzgl. einer unbeabsichtigten Temperaturänderung. Eine solche ist gerade im Sommer (morgens-mittags) nicht ungewöhnlich. Zu was kann sie u. a. führen? Eine Temperaturänderung beeinflusst in der Regel die Selektivität wesentlich stärker als die Retentionszeit, siehe Abbildung 1. Sogar eine Abnahme der Temperatur um 10 °C führt zu einer Verschiebung der Retentionszeit lediglich von 22,17 auf 22,79 min. Die Selektivität ändert sich dagegen merklich: Antrennung im hinteren Bereich des Chromatogramms und 1 Peak im kritischen Bereich bei 20 °C vs. Basislinientrennung und 3 Peaks bei…
In diesem und in diesem Tipp haben wir uns über Probleme unterhalten, die dadurch entstehen, dass unter bestimmten Begriffen etwas Anderes verstanden wird. Oder aber auch, wenn ähnlich klingende Begriffe etwas Anderes bedeuten. Derartige Missverständnisse gibt es zur Genüge, deswegen greife ich das Thema noch einmal auf. Ich beschränke mich heute auf vier Beispiele in Regelwerken, also Infos, die an AnwenderInnen im regulierten Umfeld adressiert sind.
Systemeignungstest (System Suitability Test, SST)
In der USP steht: „The tests are based on the concept that the equipment, electronics, analytical operations, and samples analyzed constitute an integral system that can be evaluated as such”
Im gleichen Abschnitt etwas weiter steht allerdings auch: “These system suitability tests are performed by collecting data from replicate injections of standard or other solution as specified”
Diese, beide existierenden Aussagen führen dazu, dass in einem Labor für einen SST „samples“, also reale Proben, z. B. Wirkstoff plus Placebo, verwendet werden, in einem anderen Labor jedoch lediglich Standards. Die Ergebnisse sind dabei nicht immer vergleichbar, weil jene (Peakfläche, Peakform, Präzision) evtl. von der Matrix beeinflusst werden.
Und noch ein Detail in diesem Zusammenhang: In der JP ist der Text im Prinzip identisch mit dem Text in der USP (siehe weiter oben) jedoch mit dem Zusatz „operators“(!): „…and based on the concept that the equipments, electronic data processing systems, analytical operations, samples to be analyzed and operators constitute an integral system that can be evaluated“.
Temperatur
Gerade bzgl. „Temperatur“ gibt es in Regelwerken abweichende Definitionen, nachfolgend einige Beispiele zu „kalt“:
EP : Cold or cool: 8°C to 15°C USP : Cold: Any temperature not exceeding 8°C Cool: Any temperature between 8° and 15°C JP : Cold: 1°C – 15°C WHO: Cool: Store between 8°-15°C
Ferner: Der Terminus “Standard Temperature” wird nur von der JP (20°C) und „Ambient Temperature“ nur von der WHO (between 15° to 25°C) verwendet.
Nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick über die Temperaturbereiche in einzelnen Regelwerken wider.
„In“ vs. „to“
In der Prüfvorschrift einer Monographiemethode steht: „…Disolve 100 g X to 1000 ml demin. water…“. Etwas weiter unten im Text steht: „…Disolve 2,8 g Y in 1000 ml demin. water and adjust to pH 4.5 with…“. Verstehen alle AnwenderInnen dieser PV das gleiche bei diesen Angaben, wird die mobile Phase/die Probelösung auf der gleichen Art und Weise angesetzt, zumal es sich einmal um Feststoff und einmal um Flüssigkeit handeln kann?
„Relative Retention“ vs. „Relative Retention Time”
In der USP ist einmal die Rede von „Relative Retention (r)“ und einmal von „Relative Retention Time (RRT)“ („unadjusted relative retention“). Im ersten Fall handelt es sich um den Quotienten aus zwei Retentionszeiten, normiert um die Totzeit tM, r = tR2tM/tR1tM. Im zweiten Fall lediglich um den Quotienten aus zwei Retentionszeiten RRT = tR2/tR1 .
Diese ähnliche klingende Größen können Verwirrung stiften: Bei „Relative Retentionszeit“ bezieht man beispielsweise die Retentionszeit einer Verunreinigung auf die Retentionszeit der Hauptkomponente, um gerade diese Verunreinigung zu identifizieren. Dies ist zwar eine übliche Praxis (USP: “Comparisons in USP are normally made in terms of unadjusted relative retention”) jedoch problematisch, denn: Ich beziehe eine Variable (Retentionszeit der Nebenkomponente) auf eine andere Variable (Retentionszeit der Hauptkomponente), weil ja auch die Retentionszeit der Hauptkomponente sich durch Änderung der Eluentenzusammensetzung oder des pH-Wertes oder der Temperatur selbstverständlich ändern kann. Die Verwendung der relativen Retention (Retentions- oder Kapazitätsfaktor, k) macht aus chromatographischer Sicht mehr Sinn: Durch die Division mit der Totzeit, tM, normalisiere ich, weil ich mich auf eine Zeit beziehe – eben tM –, die definitionsgemäß von stationärer und mobiler Phase inkl. pH-Wert sowie Temperatur nicht beeinflusst wird. Ich beziehe eine Variable (Retentionszeit von X) auf eine Konstante (Totzeit, also Retentionszeit einer inerten Komponente), Ergebnis: Die relative Retention (Retentionsfaktor k) ist zur Identifizierung einer Komponente bei konstanten chromatographischen Bedingungen sicherer als die relative Retentionszeit.
Fazit: Wenn es um Entscheidungen geht, steht oft sinnvollerweise die Vergleichbarkeit von Ergebnissen im Vordergrund, die „Richtigkeit“ von absoluten Zahlen ist häufig von untergeordneter Bedeutung, da Richtigkeit oft unbekannt. Um dies zu gewährleisten bedarf es der gleichen „Sprache“ und der exakt gleichen Anwendung von Tools und Größen.
Der Fall Es gibt in der HPLC mehrere Möglichkeiten, die Peaks nach vorne zu schieben. Dabei rücken sie zusammen, die Auflösung nimmt natürlich ab. So lautet eine (vor)schnelle Schlussfolgerung. Das stimmt allerdings nicht immer. Wann nicht und warum? Die Lösung Betrachten wir hier ein klassisches RP-System. Ich kann die Wechselwirkungen zwischen Analyten und stationärer Phase wie folgt verringern, die Peaks eluieren dabei früher: Den organischen Anteil der mobilen Phase bzw. die Temperatur erhöhen, den pH-Wert verändern, schließlich kann ich eine polarere stationäre Phase verwenden. Wenn meine Substanzen nun sich chemisch ähneln und dementsprechend auch chromatographisch ähnlich verhalten – man spricht…
Der Fall Sie befinden sich gegen Ende Ihrer Optimierungsbemühungen, Sie haben eine neue Methode entwickelt oder eine bestehende verbessert. Das Ganze sieht recht vernünftig aus aber 2 oder 3 Peaks sind nicht optimal abgetrennt oder eine mögliche Verunreinigung erscheint an dem Hauptpeak als Buckel. Sie haben eigentlich keine Lust mehr, und/oder auch keine Nerven, und/oder keine Zeit, großartig weitere aufwendige Sachen zu testen. Sie sind also bestenfalls bereit, sagen wir, ungefähr noch einen Tag für dieses Trennproblem zu investieren. Dann sollte aber Schluss sein. Welche relativ einfachen Dinge könnte man in diesem Fall ausprobieren, die vielleicht etwas „bringen“ könnten? Die…
Die lieben Amerikaner… Der „liebe“ Autosampler… Amerikaner sind „anders“. Ich liebe ihre offene, unkomplizierte Art. Denk- und Handlungsweise sind eher leicht nachvollziehbar, jene rational zu belegen für Europäer und andere nicht immer einfach. Wie auch immer, Manches ist nun so wie es ist, man muss es nur wissen. Es gilt die Konsequenzen zu ziehen und Vorsicht walten zu lassen. Wir sind bei den „Kleinen“, deswegen beschränke ich mich hier auf einige mögliche Missverständnisse und Fallstricke in äußerst knapper Form. Ich habe solche gewählt, die sowohl die analytische Praxis als auch das analytische Verständnis im Allgemeinen adressieren: Was heißt „0,5 %“?…
Der Fall Bekanntlich können in der HPLC, je nach Analyt und chromatographische Bedingungen, hydrophobe Wechselwirkungen dominieren oder aber es liegt ein Mischmechanismus vor. Letzteres bedeutet in aller Regel, es sind zusätzliche polare oder gar ionische Wechselwirkungen wirksam. Sterische Aspekte, die auch für kleine Moleküle eine Rolle spielen können, lassen wir hier außer acht. Nun stellt sich die Frage erstens, wann herrschen vorwiegend eher hydrophobe oder eher polare Wechselwirkungen und zweitens, welche sollte ich wann, wie begünstigen? Die Lösung Hier angesprochenes Thema ist ein sehr Komplexes und es bedarf eines nicht unbeträchtlichen Umfangs, wollte man jenes genauer behandeln. Dennoch sind aus…
Verunreinigungen Temperatur Verunreinigungen zum Ersten: Können Sie einen hartnäckigen Memory-Effekt aus dem Gerät (Autosampler, Detektorzelle usw.) weder durch Spülen mit heißem Wasser noch durch Spülen mit Acetonitril/Tetrahydrofuran/Isopropanol par toute nicht entfernen, bleibt wirklich nur der alt-bewährte Trick übrig: Passivieren mit 6N HNO3 . Details zur Durchführung, siehe hier. Verunreinigungen zum Zweiten: In einem Labor hatten die Kollegen trotz gründlichem Spülen der Anlage Monate-lang immer mit einem Memory-Effekt des zu analysierenden Wirkstoffs zu tun. Mal war der Peak im Chromatogramm kleiner, mal größer, aber er war stets zugegen – trotz neuer Säule, neuem Eluenten und … neuem Chef. Erst die sehr(!)…
Der Fall Eine Retentionszeitverschiebung hat mehrere Gründe, darüber haben wir uns häufiger unterhalten. Einer der Gründe ist eine Differenz bei der aktuellen Trenntemperatur. So weit so gut. Sie übernehmen nun eine Methode mit der Angabe „40 °C“ und stellen dementsprechend Ihren Säulenofen auf 40 °C ein. Stellen Sie nun fest, dass die Retentionszeit sich etwas verschoben hat, so würden Sie kaum eine Temperaturdifferenz als Ursache annehmen, die Temperatur-Anzeige ist ja in Ordnung und das Gerät ist qualifiziert! Tun Sie mir und Ihnen den Gefallen und seien Sie hier etwas vorsichtig. Jetzt fragen Sie sich, „ist denn 40 °C nicht gleich…
