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Wie kann ich schneller trennen?

By B Optimierung, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Nehmen wir an, Ihnen ist eine Trennung gut gelungen. Vielleicht ist die Auflösung sogar viel zu gut. Das ist zu erkennen an dem unnötig großen Abstand zwischen den interessanten Peaks. Oder es dauert sehr lange zwischen Injektion und Elution des ersten Peaks. Der nächste vernünftige Schritt wäre, eine ausreichend gute Trennung bei verkürzter Retentionszeit zu erzielen. Welche Möglichkeiten gibt es dafür? Die Lösung Nachfolgend sind einige einfache und auch etwas aufwendigere Maßnahmen aufgeführt: Maßnahmen zur Erniedrigung der Retentionszeit Kürzere Säule; z. B. liefert eine 100 mm-Säule mit 3 µm-Teilchen und der gleichen stationären Phase eine ähnliche Trennung wie…

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15. August 1994

Problem Nachweisgrenze: Wie kann ich mehr sehen?

By B Optimierung, Einstellparameter, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Nachweisgrenze, Nicht berücksichtigen

Der Fall Ein Peak, der etwa folgendermaßen aussieht: … ist sicherlich keine Wonne. Wie könnte man die Nachweisgrenze erniedrigen, was gleichbedeutend wäre mit einer Verbesserung des Peak/Rauschen-Verhältnisses? Die Lösung Es gibt glücklicherweise eine Reihe relativ leicht zu realisierenden Maßnahmen, die hier schnell zu einem besseren Ergebnis führen. Die einfachsten sind mit einem · versehen, siehe Tab. 1. Tab. 1: Maßnahmen zur Erniedrigung der Nachweisgrenze Das Fazit Wenn Sie ein(e) gelegentlicher(e) oder ständiger(e) Kämpfer(in) im Spurenbereich sind, sind optimale chromatographische Parameter für Sie viel wichtiger als für ,,normale“ Sterbliche. Hier einige Möglichkeiten: Dünne Säulen oder sogar Kapillaren Core Shell (1,3 µm)…

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14. Juli 1994

Wie kann ich die Bodenzahl erhöhen?

By B Optimierung, Bodenzahl, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Nachweisgrenze

Der Fall Hohe Bodenzahl einer Säule bedeutet, dass scharfe Peaks zu erwarten sind. D. h., bei einer gegebenen Selektivität wird die Auflösung durch die scharfen Peaks verbessert, da Auflösung der Abstand zwischen den Peaks und nicht zwischen den Peakspitzen bedeutet. Es gilt also, eine große Bodenzahl anzustreben, um eine bessere Trennung zu erreichen. Wie geht das? Die Lösung Bemerkung: Bandenverbreiterung und Tailing können als Ursachen auch Säulenüberladung und zusätzliche ionische Wechselwirkungen bzw. welche mit einer metallischen Oberfläche haben. Das wird hier ausgeschlossen. Die hier angesprochenen möglichen Maßnahmen betreffen die Säule selbst, die Apparatur und die chromatographischen Einflussgrößen. Nachfolgend eine Zusammenfassung…

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13. Juni 1994

Meine Peaks kommen zu früh – wie kann ich sie in einem RP-System nach hinten verschieben?

By B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Angenommen, Ihre Peaks kommen in einem C18-ACN/H2O- oder MeOH/H2O-System viel zu früh, sagen wir irgendwo zwischen Totzeit und zweifacher Totzeit. Wenn Sie die Säule nicht überladen haben, dann liegt der Grund wohl darin, dass Ihre Substanzen sehr polar oder sogar ionisch sind. Wie können Sie nun die Retentionszeit erhöhen? Die Lösung Nachfolgend einige Möglichkeiten: Erster Fall: k-Werte (Retentionsfaktoren, relative Retention) sollen konstant bleiben; ,,Chemie“ bleibt konstant, d. h. die Wechselwirkungen mit der stationären Phase ändern sich nicht. Maßnahme: Säulenlänge erhöhen, Fluss erniedrigen Zweiter Fall: Änderung der k-Werte, d. h. es erfolgt ein Eingriff in die Wechselwirkung Substanz-stationäre Phase:…

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12. Mai 1994

Wie kann ich bei der Injektion für schmalere Peaks sorgen?

By Auto-Sampler, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Probengeber

Der Fall Bei einer Trennung schmale Peaks zu erhalten ist unser aller Wunsch. Wie kann man diesem Wunsch näher kommen? Dazu gibt es mehrere Möglichkeiten. Es können zum einen effizientere Säulen verwendet werden, das ergibt eine höhere Bodenzahl. Auch alle Möglichkeiten, die zu einem verbesserten Peak/Rauschen-Verhältnis führen, siehe diesen Tipp, sind genauso gut zu nutzen. Hier wollen wir uns mit dem Einfluss der Injektion auf die Peakform befassen. Wir setzen voraus, dass die Säule nicht überladen und die Probe gut löslich ist. Die Lösung In der Säulenchromatographie herrscht ein mehr oder weniger laminarer Fluss. Gerade ein solcher bewirkt die Entstehung…

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11. April 1994

Wie beeinflussen die Einstellungen am PC meine Auflösung?

By B Optimierung, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die Trennung erfolgt zwar in der Säule, aber ,,sehen“ können wir sie erst auf dem Bildschirm. Bei dem üblichen 1-V-Ausgang bei älteren Detektoren sind die Einstellparameter am PC verantwortlich sowohl für die rein optische Darstellung des Chromatogramms auf dem Bildschirm als auch für die gewonnene Information. Was wäre zu beachten? Die Lösung Moderne Softwareprogramme bieten sehr viele Möglichkeiten, das Chromatogramm zu ,,manipulieren“. Z. B. automatische Basislinien-Subtraktion, programmierte Änderung der Integrationsparameter nach Ihren Vorgaben, Auto-Zero-Funktion und automatische Skalierung, automatische Kalibrierung bei nichtlinearem Signal/Konzentrationsverhältnis usw. Es lohnt sich, diese Möglichkeiten zu kennen und bei Bedarf einzusetzen. Die drei Grundeinstellungen, die…

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10. März 1994

Wie vermeide ich Memory-Effekte?

By A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps

Der Fall Unerwartete Peaks im Chromatogramm können mehrere Ursachen haben. Luftblasen, Verunreinigungen, spät eluierende Substanzen und eben Memory-Effekte. Wie wird der Memory-Effekt als solcher erkannt und wie kann dieser dann eliminiert werden? Die Lösung Vom Memory-Effekt sprechen wir, wenn eine Substanz irgendwo im System irreversibel adsorbiert wird und später durch teilweise Desorption als Peak oder „Buckel“ im Chromatogramm erscheint. Die Gründe für diese Teil-Desorption der Substanz können Flusserhöhung, Druckstoß, Lösungsmittelwechsel oder plötzliche Änderung der Elutionskraft z. B. beim Stufengradienten sein. Oder aber, die Kapazität einer pseudostationären Phase ist erschöpft. Es kann auch sein, dass ein Memory-Effekt die ganze Zeit vorhanden…

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9. Februar 1994

Chemisches Tailing bei Anwesenheit von Metallionen

By A Fehlersuche, HPLC-Tipps

Der Fall Das chemische Tailing ist ein häufiges Problem bei der Trennung von polaren (genauer: ionischen) Substanzen in der HPLC. Als Ursachen werden freie Silanolgruppen an der Oberfläche des Kieselgels angesehen. Heute wissen wir, dass Metallionen in der stationären Phase einen noch größeren Einfluss auf die Trennung haben. Diese Metallionen können aus diversen Quellen, wie der Herstellung des Kieselgels, aus dem verwendeten Puffer, den Stahl- aber auch Titankapillaren usw. stammen. Ohne hier tiefer auf die Problematik eingehen zu wollen, halten wir folgendes fest: Chemisches Tailing bedeutet gehemmte Kinetik. Eine mögliche Ursache ist in der Tat die Existenz von Metallionen, die…

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8. Januar 1994

Warum funktioniert mein ,,Normal-Phase“-System nicht mehr?

By A Fehlersuche, Eluent, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Wasser

Der Fall Sie arbeiten mit einem ,,Normal-Phase“-System, z. B. SiO2 als Säule und Heptan als Eluent, es funktioniert alles wunderbar. Sie setzen nun einen frisch hergestellten Eluenten ein und … am liebsten würden Sie gleich nach Hause gehen, die Retentionszeiten sind völlig aus dem Häuschen. Wieso dies auf einmal, obwohl sonst alles im System erwiesenermaßen in Ordnung ist? Die Lösung Die mangelnde Reproduzierbarkeit in der Kieselgelchromatographie (Adsorptionschromatographie, ,,Normal-Phase“) ist, neben des limitierten Lösevermögens von organischen Lösungsmitteln für polare Substanzen, das Problem Nr. 1 dieser Systeme. Fast immer liegt der Grund im (unkontrollierten) Wassergehalt des Gesamtsystems: HPLC-Apparatur, Probe, Eluent, Säule. Wasser,…

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7. Dezember 1993

Ich habe einen großen Verschleiß an RP-Säulen, was ist zu tun?

By A Fehlersuche, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten

Der Fall Nehmen wir folgende Situation: Ihnen ist aufgefallen, dass Sie, im Vergleich zu früher, einen größeren Verschleiß an RP-Säulen haben. Ihre Säulen sind einfach schneller kaputt. Ihr Säulenlieferant ist zwar nicht sonderlich traurig darüber, doch die Ursache interessiert Sie nun doch. Was heißt eigentlich ,,kaputt“? Wenn wir vom erhöhten Rückdruck absehen, zeigt sich eine Qualitätsminderung in einer Abnahme der Bodenzahl (breite Peaks, die Packung ist nicht mehr in Ordnung) oder/und in einer Änderung der Retentionszeit (chemische Veränderung der Oberfläche der stationären Phase). Welche Gründe könnten dafür verantwortlich sein? Die Lösung Leider gibt es mehrere mögliche Gründe. Nachfolgend finden Sie…

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6. November 1993