Lassen Sie uns das neue Jahr etwas entspannt und locker angehen; der erste HPLC-Tipp des Jahres 2025 beschreibt drei, sagen wir, „spezielle“ Situationen aus dem echten HPLC-Leben. „The Beauty of Slowness“ Ein Labor beim deutschen Mutterkonzern hat viele Proben zu messen, die‘ Geräte laufen rund um die Uhr, die Anwenderinnen sind froh, dass sie das Probenaufkommen gerade noch bewältigen. Im Labor eines Tochterunternehmens in einem anderen Kontinent, welches die gleiche HPLC- Methode anwendet, herrscht eine etwas andere Arbeitskultur: Jeden Freitagnachmittag lässt man die Arbeitswoche mit ausgiebigem Plaudern bei Kaffee und Kuchen ausklingen, die restlichen Proben können ja ruhig am Montag fertig gemessen werden… Während der geselligen Zeit allwöchentlich freitags werden allerdings die Geräte immer sehr lange, sehr gründlich mit heißem Wasser und Isopropanol gespült, diese Lösungsmittel (manchmal auch zusätzlich 0,01 N HNO3 und DMF) werden auch mehrmals injiziert. Im ersten Labor: „Buckel“ in der Basislinie, Geisterpeaks, Memory-Effekt. Im Zweiten: Null Probleme; Gerät, Autosampler und Säule werden ja regelmäßig gründlichst gespült, allerlei Verunreinigungen verlassen zwangsläufig das Gerät – gemütliche Zeit während der etwas Vernünftiges passiert, ist eine doppelt gewinnbringende Zeit. Merke: Im Falle einer schwierigen Matrix (Salbe, Tween, Cellulose, Lipide usw.) bleibt ein gründliches Spülen der Anlage inkl. Säule mit Lösungsmitteln…
Der Fall Vorbemerkung: Die Rede ist hier von RP-Phasen und von kleinen Molekülen, Biomoleküle ist eine ganz andere „Story“ ebenso wie Ionenaustauscher und HILIC … Als Faustregel gilt: 10-15 Säulenvolumina sollten reichen. Das Säulenvolumen kann in erster Näherung mit folgender empirischer Formel berechnet werden: Vs = tM x F/0,8 mit: Vs: Säulenvolumen in ml tM: Totzeit in min F: Fluss in ml/min Für eine 125 x 4 mm Säule beispielsweise (Fluss 1 ml/ min, Totzeit 1 min, Säulenvolumen ca. 1,25 ml), würden somit ca. 15-20 ml ausreichen. Nun, wie „gut“ ist diese Faustregel? Die Lösung Weiter oben vorgestellte Faustregel ist gut anwendbar für MeOH/Wasser- und ACN/Wasser-Eluenten ohne Zusätze. Ferner für eher saubere Proben, also keine Umwelt- oder biologische Proben bzw. stark kontaminierten Proben. Jetzt kommen wir zu den „schwierigeren“ Fällen, also zu Fällen, bei denen diese Faustregel ungenügend ist: Das notwendige Volumen zum Equilibrieren ist hier größer: Ältere Säulen, d.h. welche auf Basis von Kieselgel der ersten Generation (z. B. LiChrospher, Spherisorb, Bondapak, Supelcosil) sowie generell polare RP-Säulen wie Phenyl, Cyano oder Pentafluorphenyl, ferner Mixed-Mode-Phasen Stationäre Phasen mit größer spezifischer Oberfläche, z. B. 350 oder 400 m2/g. Solche haben i.d.R. kleine Porendurchmesser. Anders formuliert: Eine stationäre Phase mit 60 oder 80 Å-Poren…
Permanent auftretender Geisterpeak Faustregeln zu Log P und Log D Abnahme der Auflösung – eine mögliche Ursache Seit kurzem erscheint ein Geisterpeak bzw. stets ein Blindwert im Blank… Seit einiger Zeit taugt bei einer Methode – oder bei mehreren – die noch vor kurzem keine Probleme machte(n), ein Geisterpeak auf. Oder aber, Sie haben in Ihrem Blank auf einmal stets einen Blindwert. Und dieses Problem haben Sie unabhängig von der Anlage, dem/der Anwender(in) und sogar der Methode. D.h. das übliche Fehler-Ausschluss-Programm haben Sie gründlich aber leider erfolglos absolviert. Versuchen Sie in einem solchen Fall im Team sich zu erinnern,…
Der Fall Eine RP-Säule sollte ab und an gespült werden; erfahrene AnwenderInnen wissen wie, z. B: „Übliche“ Spülprozedur, oft vollkommen ausreichend: 70-80% Acetonitril (ACN)- oder Methanol (MeOH)-Wasser-Gemisch Imfalle von polaren Verunreinigungen: 90-95% H2O, Rest: ACN oder MeOH Imfalle von apolaren Verunreinigungen: 80-100% ACN oder MeOH Soweit, so gut – nur: Bei unbekannten Verunreinigungen müsste man – um des Erfolges sich recht sicher zu sein – einmal mit „viel“ Wasser und einmal mit „viel“ ACN spülen, was schon zeitaufwendig ist. Ferner: Bei unbekannten Verunreinigungen und/oder „schwieriger“ Matrix ist man nach etwaiger Spülprozedur doch unsicher, in wieweit sie erfolgreich verlaufen ist. Gibt...
Optimale Zeitpunkt für die Elution der wichtigsten/kritischen Peaks
Lagerung in MeOH/ACN
Isokratische Stufe beim Gradienten im Fall von kurzen Säulen
„Optimale“ Elution – wann sollen meine wichtigsten Peaks eluieren?
Zunächst direkt die Aussage: Die optimale Elution für die interessierenden Peaks liegt nach ca. der drei bis fünffachen Totzeit („Front“, Injektionspeak). Sehen Sie zu, dass – wenn irgendwie möglich – wichtige/kritische Peaks bei einem Retentionsfaktor, k (k: Maß für die Stärke der Wechselwirkungen), von etwa drei bis fünf eluieren, d.h. eben nach der drei bis fünffachen Totzeit. Warum? Hier drei Gründe: 1. Ab hier etwa fängt der robuste Bereich an. Die Konsequenz: Konstante Retentionszeiten in der Routine; kleine ungewollte Veränderungen beim Eluenten oder bei der Temperatur wirken sich kaum aus 2. Dieser Bereich entspricht einem optimalen Bereich der Wechselwirkungen. Die Konsequenz: Optimaler Beitrag von k sorgt für eine gute Auflösung 3. In diesem Bereich ergibt sich eine gute Effizienz (gute Bodenzahl). Die Konsequenz: Keine übermäßige und damit störende Peakverbreiterung
In Methanol/Wasser gelagerte Säulen
Für längere Zeiträume (mehrere Wochen/Monate) eignen sich zur Lagerung von polaren RP-Phasen eher ACN/H2O- (mehr als ca. 60 % ACN) als MeOH/H2O-Gemische. Begründung: In einem ACN/H2O-Gemisch ist die Gefahr der Abspaltung durch Hydrolyse von kleinen, polaren funktionellen Gruppen, z. B. C8, C4, Diol, CN, PFP, Phenyl-Hexyl usw. – also das bekannte „Bluten“ der Säule – nahezu unerheblich. 100% Methanol dürfte dagegen unkritisch sein. Soweit, so gut. Nun, einige Hersteller liefern ihre Säulen in MeOH/H2O. Was kann jetzt passieren? Sie arbeiten mit einer recht polaren RP-Säule und die Trennung funktioniert bestens. Sie bestellen beim gleichen Hersteller erneut die gleiche Säule, mit dem Herstellerhinweis, dass es sich um die gleiche Charge wie bei der ersten Säule handelt, dennoch sieht Ihr Chromatogramm „scheußlich“ aus. Es mag sein, dass es sich um die gleiche Säulen-Charge handelt. Die zweite jedoch war beim Hersteller eventuell längere Zeit gelagert. Ein Teil der polaren funktionellen Gruppen, siehe weiter oben, ist womöglich abgespalten und man erhält im Fall von basischen Komponenten beispielsweise stark tailende Peaks, denn: Jene interagieren nun mit frei gewordenen aktiven Silanolgruppen.
„Gleiche“ Charge ist nicht für jeden dasselbe…
Es ist zweifelsohne sinnvoll, im Rahmen der Methodenentwicklung oder später bei der Validierung drei Säulenchargen auszutesten. Hier ist Vorsicht geboten: Wenn Sie beim Hersteller drei Säulen aus drei „verschiedenen Chargen“ bestellen, bekommen Sie meist tatsächlich drei Säulen aus drei unterschiedlichen Herstellungsschargen. Für manchen Hersteller jedoch bedeutet „unterschiedliche Chargen“, dass die Säulen zu unterschiedlichen Zeitpunkten gepackt worden sind, sie sind jedoch aus der gleichen Herstellungscharge…
Denke an MeOH bzw. MeOH/ACN-Gemische
Wasser aus dem Eluenten wird an der Oberfläche von polaren, stationären Phasen adsorbiert. Bei der Trennung von polaren Komponenten wirkt sich dies positiv aus. Als organisches Lösungsmittel eignet sich bei Trennungen von polaren Komponenten tendenziell eher Methanol als Acetonitril. Erwarten Sie nicht ausschließlich stark polare Komponenten sondern auch moderat-polare und evtl. auch neutrale (apolare) Komponenten? Für diesen Fall folgender Vorschlag: Wenn Sie Ihren Gradienten beispielsweise mit 20% B starten und auf 80% B hochfahren möchten, könnten Sie mit 10% MeOH/10% ACN starten und dann auf 40% MeOH/40% ACN hochfahren: Sie nutzen in diesem Fall die gute polare Selektivität durch das Methanol und die gute Peakform durch das ACN (geringe Viskosiität, scharfe Peaks). Generell gilt: Eine ternäre Mischung, also Wasser bzw. Puffer-ACN-MeOH, erweist sich bei einer großen Polaritäts-Bandbreite der Komponenten in der Probe oft als vorteilhaft. Dies gilt auch und gerade bei isokratischen Trennungen.
Großes Verweilvolumen und kleines Säulenvolumen…
Ein großes Verweilvolumen („Dwell“- oder „Delay-Volume“) bei einer Gradientenanlage bedeutet, dass zu Beginn des Gradienten eine isokratische Stufe vorgeschaltet ist. Eine solche mag mitunter etwas Positives bewirken: Manche Peaks am Chromatogramm-Anfang werden besser abgetrennt, als wenn der Gradient „sofort“ an der Säule wäre und dort direkt wirkte. Bei einer kurzen Säule jedoch „sieht“ der Gradient im Fall eines längeren isokratischen Schrittes am Anfang nur einen Teil der Säule, d.h. es werden im schlimmsten Fall nur 50% der Säulenlänge ausgenutzt. Die Peaks werden nach hinten „gestaucht“, bei mehr als 10-15 Peaks werden die letzten Peaks evtl. schlecht abgetrennt.
von Werner Röpke, Braunschweig Das Problem Unerklärliche Druckschwankungen in einem Pumpensystem, die aber nur auftreten, wenn Wasser gefördert wird. Der Kanal mit Acetonitril oder einem ähnlichen Laufmittel arbeitet völlig einwandfrei, so dass ein Fehler an der Pumpe eigentlich ausgeschlossen werden kann. Was könnte hier vorliegen? Die Lösung Jetzt sollte der Pfad des Laufmittels von der Flasche zur Pumpe untersucht werden, denn sehr häufig ist die Ansaugfritte – auch Ansaugfilter genannt – Verursacher des Problems. Stellen wir uns ein typisches HPLC-System mit zwei Flaschen vor, eine ist mit Wasser gefüllt und eine mit Acetontril. Die Ansaugschläuche sind vollständig gefüllt, die Pumpe…
„Dreck“ bzw. Matrix mal anders… „Dreck“ in einer HPLC-Anlage ist unangenehm, jener kann unterschiedlichen Ursprungs sein: Matrixbestandteile, Verunreinigungen aus der Probelösung oder dem Eluenten, Polymere aus dem Acetonitril, Kontaminationen aus dem Gerät etc. Eluiert der „Dreck“ einmalig oder unregelmäßig mit der mobilen Phase, lauten die üblichen Probleme: Geisterpeak(s), „Buckel“, „Wellen“, „Gebirge“ in der Basislinie, verstärktes Rauschen. Haftet er jedoch irreversibel oder auch länger an diversen Oberflächen wie Fritten, Injektionsnadel, Septum, Verbindungsstücke, „column saver“ (on-line Filter vor der Vorsäule) etc., müssen wir in diesem Fall mit einer weiteren Konsequenz rechnen: Memoryeffekt bzw. Retentionszeitverschiebung. Nachfolgend zwei Beispiele zur Retentionszeitverschiebung: In PV´ s…
Peaks eluieren früher und ihre Peakbreite hat zugenommen – eine mögliche Ursache: Wir gehen davon aus, dass weder die Packungsqualität noch eine Verschiebung des pH-Wertes als Ursache infrage kommt. Der Grund könnte u.a. Schmutz an der Oberfläche der stationären Phase sein. Tritt dieser Fall ein, so ist ein Teil der aktiven Zentren belegt, die Wechselwirkungen nehmen ab, die Peaks eluieren früher. Ferner führt die geringer gewordene Zahl der aktiven Zentren, die für eine Wechselwirkung mit den zu trennenden Komponenten nun zur Verfügung stehen, zu einer lokalen Überladung der Säule. Das ist die Ursache für die Peakverbreiterung. Auf der Seite der…
Der Fall Manch´ ein Peak eluiert auf einer Flanke. Die Flanke kann u.a. ein abfallender Gradient, ein sehr langsam eluierender Peak oder einfach Matrix sein. Angenommen, das Problem ist chromatographisch nicht zu lösen, wie könnte man vorgehen, um den Fehler bei der Bestimmung der Peakfläche zu minimieren? Die Lösung Im Falle vom Gradienten haben wir an dieser Stelle bereits darüber gesprochen, wie eine Lösung aussehen könnte: Blindgradient bzw. das Chromatogramm einer Matrixinjektion (Matrixlösung ohne Probe) vom Original-Chromatogramm abziehen und das Differenz-Chromatogramm integrieren. Hier möchte ich kurz auf zwei etwas anders gelagerte Fälle eingehen. Fall 1 In Abb. 1 sind sechs…
Der Fall Dass eine HPLC-Säule ab und zu gespült werden muss, ist eine Binsenweisheit. Nur, wie macht man so etwas effektiv – es soll gründlich und es soll auch ökonomisch sein. Wenn Sie im Labor eine entsprechende Spülprozedur haben mit der Sie zufrieden sind, besteht natürlich kein Handlungsbedarf. Und Sie sind wahrscheinlich zufrieden, wenn Sie erstens bei Ihren Läufen keine Geisterpeaks, keinen Memoryeffekt, keine „Buckel“ etc. feststellen und zweitens die ganze „Spülerei“ keine 2-3 Stunden in Anspruch nimmt. Sollte allerdings einer dieser zwei Fakten zutreffen, bestünde womöglich Optimierungspotenzial. Nachfolgend finden Sie einen Vorschlag. Die Lösung 1. Verunreinigungen Vorbemerkung als Erinnerung…
