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Fehlersuche Archive - Seite 3 von 6 - Dr. Stavros Kromidas

Das kann mit der Probe in der Säule passieren

Von A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Probe

Der Fall Kieselgel ist ein sehr guter Feststoffkatalysator, er wird vielfach in der chemischen Industrie eingesetzt. In der RP-Chromatographie nun, wo ja Kieselgel die mit Abstand wichtigste Matrix darstellt, führt seine Umsetzung mit Silanen aufgrund von sterischen Effekten zu einem Umsetzungsgrad von lediglich ca. 50-70%. Das bedeutet, dass RP-stationäre Phasen eine „nackte“ Kieselgeloberfläche von immerhin ca. 30-50% aufweisen können. Die katalytische Wirkung von Kieselgel kann dazu führen, dass manch eine Substanz in der Säule chemisch verändert wird. Das Ergebnis: Peaks, die im Chromatogramm erscheinen, könnten Substanzen sein, die in der Säule durch die katalytische Wirkung des Kieselgels entstanden sind und…

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27. April 2010

Effektives Spülen einer RP-HPLC-Säule

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Dass eine HPLC-Säule ab und zu gespült werden muss, ist eine Binsenweisheit. Nur, wie macht man so etwas effektiv – es soll gründlich und es soll auch ökonomisch sein. Wenn Sie im Labor eine entsprechende Spülprozedur haben mit der Sie zufrieden sind, besteht natürlich kein Handlungsbedarf. Und Sie sind wahrscheinlich zufrieden, wenn Sie erstens bei Ihren Läufen keine Geisterpeaks, keinen Memoryeffekt, keine „Buckel“ etc. feststellen und zweitens die ganze „Spülerei“ keine 2-3 Stunden in Anspruch nimmt. Sollte allerdings einer dieser zwei Fakten zutreffen, bestünde womöglich Optimierungspotenzial. Nachfolgend finden Sie einen Vorschlag. Die Lösung 1. Verunreinigungen Vorbemerkung als Erinnerung…

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21. Februar 2010

Integration von Peaks auf einer driftenden Basislinie

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Integration

Der Fall Bei Gradiententrennungen oder im Falle von Matrix-belasteten Proben müssen oft Peaks, die sich auf einer mehr oder weniger stark driftenden Basislinie oder auf einem flachen „Buckel“ befinden, integriert werden. Die Frage ist nun, wie tut man so etwas am besten? Da die meisten Anwender nicht über Peakhöhen auswerten, wird hier auf diese – oft sinnvolle – Möglichkeit nicht weiter eingegangen. Die Lösung Nachfolgend werden für zwei Fälle Lösungsansätze vorgeschlagen, die sich nach aufwendigen Überprüfungen als das kleinere Übel erwiesen haben (1). 1. Nicht-aufgelöste Peaks auf einer abfallenden Basislinie, s. Abb. 1. (Das Beispiel wurde freundlicherweise von Hans-Joachim Kuss…

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29. Januar 2010

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, ACN, Chromatogramm, Eluent, HPLC-Tipps, Integration, Uncategorized, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Verschiebung der Retentionszeit (2) Im diesem Tipp haben wir uns mit der Verschiebung der Retentionszeit beschäftigt, die Ursachen lagen in einer Veränderung der stationären Phase im Sinne der „Chemie“. Hier werden wir uns Änderungen der mobilen Phase widmen. Auch in diesem HPLC-Tipp geht es um ungewollte Veränderungen, also um solche, die nicht vom Anwender bewusst vorgenommen wurden, z. B. Eluenten-Zusammensetzung oder pH-Wert verändert. Nachfolgend werden einige Gründe für eine veränderte Eluenten-Zusammensetzung genannt. Sie resultieren durch kleine, ungeachtete/unbedachte Variationen beim Ansetzen der mobilen Phase oder während der Trennung. Ein Eluent wird z. B. manchmal dadurch hergestellt, dass der Puffer und die…

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29. Juli 2009

Die „kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Uncategorized, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Hier geht es um eine unerwartete Verschiebung der Retentionszeit, d.h. um eine, die ohne eine bewusste Veränderung seitens des Anwenders erfolgt ist, also: Es wurde keine längere/kürzere/dünnere Säule eingebaut oder die Flussrate geändert. Grundsätzlich liegt in einem solchen Fall eine Verschiebung der Retentionszeit an einer Änderung der Temperatur, der stationären Phase (d.h. „Chemie“ der Oberfläche) und des Eluenten. Ungewollte Temperaturänderung stellt ein eher seltenes Problem dar, deswegen werden wir uns hier zunächst mit der stationären und dann dort mit der mobilen Phase befassen. Veränderung der stationären Phase Bemerkung: Es geht hier um eine Veränderung im Sinne der „Chemie“, d.h. nicht…

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29. Juni 2009

Einfluss von Einstellparametern auf die Trennung

Von A Fehlersuche, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, kleine Peaks, Methodentransfer, Nachweisgrenze, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Im diesem Tipp ging es um den Einfluss von Einstellparametern auf die Peakform und damit auch auf die Auflösung. So „verschwinden“ schmale, früh eluierende Peaks bei zu groß eingestellten Werten für die Zeitkonstante (z. B. 0,7-1 s) bzw. zu kleinen Datenraten (z. B. 1-2 Hz). Nun mache ich in Seminaren und Workshops die Erfahrung, dass auch erfahrene Anwender die Brisanz der Einstellparameter unterschätzen. Deswegen greife ich hier das Thema erneut auf und gehe kurz auf den Einfluss der Bandbreite (engl. „bandwidth“) bei einem Dioden Array Detektor auf das chromatographische Ergebnis ein. Die Lösung Abb. 1 Zum Einfluss der…

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29. März 2009

In wie weit beeinflusst die Probelösung die Auflösung?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Im diesem Tipp haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probelösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit auch auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probelösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Hier möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probelösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probelösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer…

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29. Januar 2009

Die Retentionszeit bleibt konstant – ist somit auch der Fluss automatisch OK?

Von A Fehlersuche, Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Fluss, HPLC-Tipps, Pumpe, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Sie stellen fest, dass bei Wiederholinjektionen einer Probe die Retentionszeit konstant bleibt. Bedeutet dies, dass alle Faktoren, die die Retentionszeit beeinflussen können, also – neben Temperatur, Eluent und stationärer Phase – auch der Fluss in Ordnung sind? Die Lösung Bei den drei Erstgenannten zweifelsohne, beim Fluss nicht unbedingt. Erläuterung: Bekanntlich unterscheiden wir bei einer Pumpe zwischen der Langzeit- und der Kurzzeitkonstanz. Wenn die Retentionszeit bei Wiederholinjektionen konstant bleibt, ist die Langzeitkonstanz der Pumpe (also die Streuung des Flusses im Langzeitbereich) in der Tat OK. Daneben gibt es aber auch die Kurzzeitkonstanz der Pumpe: Konstanz des Flusses im Kurzzeitbereich,…

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7. November 2008

Einfluss des Probelösungsmittels auf die Trennung

Von A Fehlersuche, B Optimierung, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Wir haben uns bereits über den Einfluss der Probelösung auf die Peakform und somit auf die Trennung unterhalten. So führt ein zu starkes Probelösungsmittel (Probe z. B. in mehr MeOH oder ACN im Vergleich zum Eluenten) zum Fronting oder gar zu Doppelpeaks, andererseits führt ein schwaches Probelösungsmittel – mehr Wasser im Vergleich zum Eluenten – zur Aufkonzentrierung am Säulenkopf und somit zu einer Verbesserung der Peakform. Die Folge lautet im zweiten Fall: Verbesserung der Auflösung bzw. Erniedrigung der Nachweisgrenze, vor allem bei früh eluierenden Peaks. In letzter Zeit haben wir uns intensiv mit der Injektion befasst und haben…

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7. Oktober 2008

Empfehlungen in Geräte-Handbüchern – seien Sie etwas vorsichtig!

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Handbücher von Gerätehersteller sind meist sehr nützlich – zwar manchmal viel zu umfangreich und von Softwarespezialisten statt von Analytikern verfasst, aber dennoch: Manches wird erst nach deren Lektüre wirklich klar. Trotzdem ist Vorsicht geboten: Einige Empfehlungen sind irreführend oder einfach falsch. Welche Beispiele könnte man diesbezüglich anführen ? Die Lösung Dergleichen gibt es einiges, hier möchte ich beispielhaft auf zwei Empfehlungen bzgl. Einstellparameter eingehen: 1. In manch einem Manual steht, dass ein Peak mit 20-25 Datenpunkten ausreichend darstellbar sei. Dies stimmt jedoch nicht für schnelle Peaks. Bei einer Peakbreite von z. B. 9 s im Falle eines schnell…

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7. September 2008