Übernahme einer Methode in die Routine, Formulierungen in Prüfvorschriften… Eine Gradienten-Methode wurde mit einer Pumpe entwickelt, die keinen Pulsationsdämpfer enthielt. Das merkliche aber doch eher geringe Rauschen der Basislinie hat den Methodenentwickler nicht weiter gestört. Der Routineanwender hat für sein baugleiches Gerät (Niederdruckgradient) einen Pulsationsdämpfer bestellt und einbauen lassen, weil er bei den zu erwartenden kleinen Peaks größere Probleme in der täglichen Integration verhindern wollte. Das Rauschen war tatsächlich signifikant kleiner geworden. Aber: Die Retentionszeit hat sich verschoben, das Chromatogramm sah anders aus. Erklärung: Durch den Pulsationsdämpfer hat sich das Verweilvolumen (Dwell volume) der Apparatur geändert und dies kann leider…
Der Fall Mit einigen Anwendern habe ich vor Ort ein Paar einfache Optimierungsexperimente durchgeführt. Wir haben einiges ausprobiert, nachfolgend werden 1-2 Ergebnisse vorgestellt. Uns ging es vor allem um die Frage: Was ist mit einfachen Mitteln möglich und was „bringt“ wann, was? Die Lösung Vorbemerkung: In den Abbildungen weiter unten werden Chromatogramm-Ausschnitte aus längeren Läufen gezeigt. Man betrachte Abb. 1. Es handelt sich um die Injektion von 50 µl einer recht komplexen Probe (Linearer Puffer/ACN-Gradient, Fluss: 1,6 ml/min, Kromasil C18, 5µm). Abb. 1 Injektion einer 50 µl Probe bei F=1,6 ml/min, Details, siehe Text Im vorliegenden Fall interessiert am meisten…
„Trennleistung“, „Effizienz“, „Bandenverbreiterung“ das alles bedeutet doch fast das gleiche – oder?
Der Fall Betrachten wir folgende drei Säulen: 250 mm 5 µm, 150 mm 3 µm und 75 mm 1,5 µm. Mit Hilfe der empirischen Formel: Bodenzahl = 3.000 x Länge der Säule in cm durch Teilchengröße in µm stellen wir leicht fest, dass alle drei Säulen – vorausgesetzt sie sind gleich gut gepackt – die gleiche Bodenzahl, nämlich 3.000 x 5 = 15.000 Böden liefern. Sind nun die Säulen wirklich vergleichbar, kann ich also bei gleicher Bodenzahl (15.000 Böden) und völlig identischen chromatographischen und apparativen Bedingungen die gleiche Trennung, sprich die gleiche Auflösung erwarten? Bemerkung: Vorteile der kürzeren Säulen wie…
Der Fall Im diesem Tipp haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probelösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit auch auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probelösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Hier möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probelösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probelösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer…
Der Fall Nehmen wir an, dass eine der Forderungen in der Prüfvorschrift einer Routine-Methode lautet: „Bodenzahl für Peak X mindestens 5.000“. Dass ich der Meinung bin, dass eine derartige Forderung unnötig ist, bringt nichts zur Sache, lassen Sie mich dennoch diese These kurz erläutern: Bei einer Trenntechnik wie der HPLC geht es ja um Trennung und das wichtigste – um nicht zu sagen das ausschließliche – Kriterium für eine ausrechende Trennung ist die Auflösung (Auflösung, vereinfacht: Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis). Wenn ich nun die geforderte Auflösung von beispielsweise 1,3 oder 1,5 erreiche, bedeutet dies, dass ich in…