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Peakhomogenität Archive - Dr. Stavros Kromidas

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Das Nonplusultra zur Überprüfung der Peakhomogenität: Multidetektion und 2D-Chromatographie

Von B Optimierung, Chromatogramm, Detektor, Jahrestipps, LC-MS-Kopplung, Optimierung

Zusammenfassung Multidetektion und insbesondere 2D-Chromatographie sind die besten Tools, um Peakhomogenitäten zu überprüfen bzw. mittels letzterer die Auflösung zu verbessern. Der Aufwand jedoch bei der Etablierung einer 2D-HPLC sollte nicht unterschätzt werden. Ferner sind zwei Nachteile bei 2D-Anwendungen zu nennen: Mangelnde Robustheit und Verlust an Empfindlichkeit. Der Fall Beim letzten HPLC-Tipp haben wir uns den orthogonalen Test angeschaut: Eine gänzlich andere Säule und/oder ein gänzlich anderer Eluent sind sehr hilfreich, um die Peakhomogenität (Peakreinheit) zu überprüfen. Heute geht es um die in diesem Zusammenhang vermutlich zwei besten Tools: Stufe 1, recht einfach: Einsatz eines zweiten/dritten Detektors; Multidetektion ist mittlerweile in vielen Laboren eine Selbstverständlichkeit Stufe 2, recht aufwendig: „2D“ (2-dimensionale Chromatographie) anwenden; 3D gibt es zwar auch schon seit jeher – aber lassen wir es hier lieber … Was hat denn beides auf sich? Die Lösung Multidetektion Ein zweiter/dritter Detektor in Serie kann erstens Peaks detektieren, die bei Verwendung nur eines Detektors unsichtbar bleiben und zweitens Peaks, die schlecht abgetrennt sind, wenigstens als solche erkennen. In Abb. 1 wird die Verunreinigung bei 6,72 min nur mit MS (ESI-Positiv), jedoch nicht mit DAD erkannt (oberes Bild). Im ESI-Negativ-Modus (unteres Bild) ist zwar das Signal bei 6,72 min wesentlich größer, dafür fehlt…

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14. Juli 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Der orthogonale Test: Bester Test bzgl. Nutzen/Aufwand-Verhältnisses zur Prüfung der Peakhomogenität

Von ACN, Allgemein, Chromatogramm, Eluent, Jahrestipps, Lösungsmittel, Optimierung, Säule, Säulenauswahl, Stationäre Phase, Veränderung des Chromatogramms

Zusammenfassung: Orthogonaler Text: Verwende eine „ganz“ andere Säule (z. B. statt einer C18 nun eine PFP oder eine Mixed Mode) und/oder einen anderen Eluenten (mobile Phase statt mit ACN nun mit MeOH) und injiziere erneut. Ähnliche Substanzen gehen wahrscheinlich (etwas) andere Wechselwirkungen mit der stationären Phase ein. Somit offenbart sich, dass ein symmetrischer Peak evtl. doch nicht homogen ist. Der Fall In den letzten zwei HPLC-Tipps haben wir folgendes gesehen: Eine Änderung von Einstellparametern („Settings“) sowie „Manipulationen“ der Probelösung stellen schnelle Möglichkeiten dar, die Peakhomogenität zu prüfen. Heute geht es um den orthogonalen Test. Was ist das und was „bringt“ er? Die Lösung Am Ende einer Methodenentwicklung kommt häufig die Frage auf: „Habe ich alle Peaks trennen können, oder liegt womöglich irgendwo im Chromatogramm doch eine Koelution vor“? Jetzt kommt der orthogonale Test ins Spiel – die Idee dahinter: Man verwende eine völlig andere stationäre Phase oder einen anderen Eluenten und injiziert erneut. Es ist ziemlich unwahrscheinlich, dass zwei oder drei Komponenten bei Verwendung zweier gänzlich (!) unterschiedlichen Säulen bzw. Eluenten in beiden Fällen völlig gleich starke Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen. Wenn nun mit einem Eluenten an zwei unterschiedlichen Säulen oder mit zwei unterschiedlichen Eluenten an einer Säule…

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22. Mai 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Schnell durchzuführende Tests zur Prüfung der Peakhomogenität – im Focus heute: Die Probelösung (Diluent).

Von Allgemein, B Optimierung, Injektionsvolumen, Jahrestipps, Lösungsmittel, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel

Der Fall Wie beim vorherigen HPLC-Tipp geht es auch heute um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Beim letzten Mal haben wir gesehen, dass eine Änderung der Einstellparameter („Settings“) durchaus hilfreich sein kann. Heute steht die Probelösung im Focus: Schnell durchzuführende „Manipulationen“ bzgl. Probelösung können ebenso helfen. Welche wären das? Die Lösung Verdünne die Probelösung oder injiziere weniger Wir alle überladen öfters als gedacht die „arme“ Säule. Ergebnis: Verschlechterung der Auflösung. Eine lokale Überladung der Säule macht sich vor allem am Anfang des Chromatogramms bemerkbar; dort eluieren in einem RP-System polare Komponenten, die zusätzliche polare Wechselwirkungen mit der Oberfläche der stationären Phase eingehen können („Dualer Mechanismus“). Die Devise lautet: Probelösung, also Diluent, einfach mit Wasser verdünnen oder vielleicht noch einfacher: Weniger injizieren. In Abbildung 1, rechts, wird die Injektion von 20 µl Acetophenon gezeigt: Der erste Peak ist eine Verunreinigung, der zweite die Hauptkomponente Acetophenon. Anschließend wurde lediglich Eluent injiziert, linkes Chromatogramm. D.h. hier wurde der Memory-Effekt ausgenutzt: Es befindet sich häufig ein kleiner Rest der Probe an der Nadel, der nicht immer 100% weggespült wird. Wie man leicht erkennt, ist die Verunreinigung sauber, Acetophenon dagegen nicht: Auch mit 20 µl kann eine…

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7. April 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Einfache Tests zur Prüfung der Peakhomogenität

Von Auflösung, B Optimierung, Chromatogramm, Einstellparameter, Jahrestipps, LC-MS-Kopplung, Nachweisgrenze, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Im HPLC-Tipp vom letzten Dezember war Peaky am Zweifeln, ob er es wirklich ist: „Bin ich überhaupt der Peaky? Und wenn ja, wieso fühlt es sich so an, als wäre ich mehrere …“ Es geht also um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Im vorliegenden HPLC-Tipp werden wir uns einfache Tests anschauen, die recht schnell durchzuführen sind: Keine Änderung der chromatographischen Parameter, keine Änderung der Apparatur. In den nächsten HPLC-Tipps werden wir uns sukzessiv mit aufwendigeren Methoden beschäftigen. Die Lösung Eine Veränderung von Einstellparameter („Settings“) kann helfen, innerhalb von Sekunden/Minuten die Peakhomogenität zu überprüfen. Es lohnt sich (auch) an solche „banale“, schnelle Möglichkeiten zu denken: Injektion bei einer anderen (niedrigeren) Wellenlänge, siehe Abbildung 1: Bei 271 nm erscheint der dritte Peak als ein Peak (unteres Chromatogramm), bei 225 nm sind zwei Peaks zu erkennen (oberes Chromatogramm)   2. Eine große Zeitkonstante („Filter Response“, „Filter Time Constant“) führt zwar zu einer ruhigeren Basislinie, die Peakbreite nimmt allerdings zu, man verliert an Auflösung. Folgendes Zahlenbeispiel aus einer „Technical Note“ von Waters, die freundlicherweise von Sascha Schifrin zur Verfügung gestellt wurde: Kein digitales Filtern: Auflösung (Resolution) 3,16, Peakkapazität 16 Zeitkonstante, 0,5 Min: Auflösung 1,82,…

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19. Februar 2025

HPLC und KI mal „anders“: Ein Gespräch zwischen Peaky und Chromy

Von Bodenzahl, Chromatogramm, Peakverbreiterung, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

„Wer bin ich? Und bin ich allein? Und wieso verändere ich mich? (Peaky ist ein kleiner, unruhiger, quirliger Peak, häufig als „Nervensäge“ unterwegs. Chromy dagegen ist ein großer, gemütlicher Peak aus der Nähe von Hydrophobenhausen, in der Regel cool, fast apathisch. Sie sitzen heute wieder im Karussell am aller letzten Platz und warten bis sie injiziert werden, haben also genügend Zeit für ein Schwätzchen) Die Probleme von Peaky Chromy: Peaky, was ist los mit dir, warum bist du so down? Peaky: Ich bin am Zweifeln: Bin ich überhaupt der Peaky? Und wenn ja, wieso fühlt es sich so an, als wäre ich mehrere und wieso gehe ich so auseinander, mein Gewicht bleibt doch gleich? Chromy: Also, ich kann dir garantieren, du bist es und du bist allein, das sehe ich doch … Peaky (energisch): Dein Freund DAD behauptet es auch. Am Freitag hat er auch nur einen Peak gesehen, aber neben 2-Nitroanilin waren auch 20 % 4-Nitroanilin dabei… Chromy: Ja, aber … Peaky (schon etwas erregt): Nix aber! Es geht um MICH Mann, es geht um Wahrheit, kein formales Alibi-Zeugs und so! Chromy: Beruhige dich doch… Peaky: NEIN! Chromy: Aber ich kenne dich und ich sehe dich und … (Peaky…

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30. November 2024

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Probengeber, Uncategorized, Veränderung des Chromatogramms

Die lieben Amerikaner… Der „liebe“ Autosampler… Amerikaner sind „anders“. Ich liebe ihre offene, unkomplizierte Art. Denk- und Handlungsweise sind eher leicht nachvollziehbar, jene rational zu belegen für Europäer und andere nicht immer einfach. Wie auch immer, Manches ist nun so wie es ist, man muss es nur wissen. Es gilt die Konsequenzen zu ziehen und Vorsicht walten zu lassen. Wir sind bei den „Kleinen“, deswegen beschränke ich mich hier auf einige mögliche Missverständnisse und Fallstricke in äußerst knapper Form. Ich habe solche gewählt, die sowohl die analytische Praxis als auch das analytische Verständnis im Allgemeinen adressieren: Was heißt „0,5 %“?…

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26. Juli 2011

Trennung einer unbekannten Probe in einem RP-­C18-System – wie gehe ich vor?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, Säulenauswahl

Der Fall Nehmen wir an, Sie möchten eine mehr oder weniger unbekannte Probe in einem RP-C18-Sy­stem chromatographieren. Wie sollen Sie nun das chromatographische System aussuchen? Betrachten wir das Ganze aus einem etwas anderen Blickwinkel als in diesem HPLC-Tipp. Die Lösung Nachfolgend erholten Sie einen groben Grund-­Leitfaden, der  – je nach individuellen Gegeben­heiten  – weiter „verfeinert“ werden kann. 1. Grundvoraussetzungen Probe im Eluenten (H2O/MeOH bzw. H2O/ ACN) wenigstens teilweise löslich Molekulargewicht für isokratische Trennungen vorzugsweise bis ca. 400-500. Molekulargewicht für Gradiententrennungen bis ca. 2000-3000. Wenn das Molekularge­wicht unbekannt ist, bedienen Sie sich folgen­den Tricks: Elution vor t0 (Totzeit) bedeutet, dass die Probe ausgeschlossen…

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8. Mai 1997