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Selektivität Archive - Dr. Stavros Kromidas

Sprechen wir alle die gleiche „Sprache“? (I)

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps Demo

Der Fall

Die unterschiedliche Bedeutung von Hersteller-Abkürzungen sowie die Synonymisierung von an für sich unterschiedlichen Begriffen führen immer wieder zur Konfusion. Nachfolgend möchte ich dazu einige typische Beispiele anführen. Ferner: Unterschiedliche Interpretation von chromatographischen Begriffen und Formulierungen wie auch das Gleichsetzen ähnlich klingender Begriffe kann zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen führen. Auch ein Datenvergleich kann sich dadurch als problematisch erweisen. Mit dieser verwandten Problematik werden wir uns im diesem Tipp beschäftigen. Hier finden Sie einige Synonyme in der HPLC.

Die Lösung

Gleiche Abkürzungen

Fangen wir mit dem Einfacheren an: Gehen Sie bitte nicht davon aus, dass gleiche Abkürzungen stets das Gleiche bedeuten. Dazu einige Beispiele:

„HD“ bei Agilent: High Definition
„HD“ bei Macherey Nagel: High Density (stationäre Phase mit ca. 20% Kohlenstoff)
„SB“ bei Waters: Strong Bond
„SB“ bei Agilent: Stable Bond (sterischer Schutz, im Sauren stabil)
„HT“ bei Agilent und Thermo beispielsweise wird für „High Throughput“ verwendet, während bei Waters, Tosoh Bioscience und anderen „HT“ für „High Temperature“ steht.
Auch Zahlen können beim Namen einer Säule etwas Unterschiedliches bedeuten, hier einige Beispiele: Die „2“ ist oft der Hinweis auf ein endcappedes Material (z. B. Inertsil 2, LUNA 2). Bei „HT2“ jedoch (Tosoh Bioscience) ist die „2“ der Hinweis, dass jenes GPC-Material bis 220 °C stabil ist, während die üblichen Hochtemperatur-GPC-Materialien („HT“) nur bis 140°C-150°C stabil sind. Die „3“ bei Inertsil ODS 3 wird als Hinweis verwendet, dass es sich dabei um ein weiteres Produkt der Inertsil-Familie handelt, das Material soll eindeutig von Inertsil ODS 2 abgrenzbar sein, welches recht andere Eigenschaften aufweist. Eine „3“ allerdings nach einem „T“ (z. B. Atlantis T3, Waters) bedeutet, dass der Ligand bei diesem Material über eine trivalente Bindung mit der Oberfläche des Kieselgels verbunden ist (T: Erster Buchstabe aus dem Griechischen „tria“ = drei).
„RP“ bedeutet bekannterweise „Reversed Phase“. „RP“ allerdings direkt nach „C18“, also in etwa „Materialname C18 RP“, ist oft der Hinweis, dass sich auf der Oberfläche dieser C18-Phase zusätzliche polare Gruppierungen befinden, dass also jene stationäre Phase einen (zusätzlichen) polaren Charakter aufweist.

Es gibt erfreulicherweise auch einfache Fälle: Die Bedeutung einer Abkürzung ergibt sich zwangsläufig aus dem Zusammenhang: „ECD“ in der GC bedeutet Electron Capture Detector, in der HPLC, Electrochemical Detector.

Unglückliche Synonymisierungen

  • Aus einem Buch „…Totvolumen, auch Verweilvolumen genannt…“ Diese Gleichsetzung ist problematisch, denn: Totvolumen (Dead Volume, Dispersionsvolumen) ist das Volumen der Apparatur vom Probengeber bis einschließlich Detektor ohne Säule. Ändert sich jenes, ändert sich die Peakform vor allem bei früh eluierenden Peaks, die Retentionszeit ändert sich dabei nur gering. Das Verweilvolumen (Verzögerungsvolumen, Dwell- oder Delay Volume) bei Gradientenanlagen ist das Volumen vom Mischventil bis zum Säulenkopf. Ändert sich jenes, kann eine Vielzahl von Effekten auftreten: Keine Änderung, Änderung der Retentionszeit, der Peakform, der Auflösung, mitunter immer wieder auch der Elutionsreihenfolge.
  • Ebenfalls aus einem Text: „…Selektivität oder Spezifität …“. Diese Gleichsetzung ist nicht richtig: Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode alle denkbaren Komponenten ohne gegenseitige Störung zu trennen. Spezifität ist die Fähigkeit einer Methode, eine Substanz oder eine Substanzklasse ohne Störung durch andere Komponenten zu trennen. Leider ist in den 1990er Jahren den Verfassern der Richtlinien der ICH (International Conference of Harmonisation) ein semantischer Fehler unterlaufen, sie verwendeten nämlich den Begriff „Specifity“. Da in diesem Papier (stillschweigend) chromatographische Methoden gemeint sind, sollte richtigerweise von „Selectivity“ die Rede sein, denn: Man schätzt sich in der HPLC-Welt glücklich, eine selektive chromatographische Methode entwickelt zu haben. Spezifität in der Chromatographie ist allenfalls nur theoretisch denkbar. Dieses sprachliche Missgeschick hat im Pharma-Umfeld manche Verwirrung gestiftet.

Das Fazit

Bei einer falsch verwendeten Synonymiesierung ist es zugegebenerweise schwierig dahinter zu kommen. Bei nicht 100%ig geläufigen Abkürzungen lohnt es sich bei Bedarf folgendes zu tun: Geschwind bei der Homepage des Herstellers nachschauen, was wohl damit gemeint ist. Es sei denn, allen Beteiligten ist klar, was mit der Abkürzung gemeint ist, z. B. bei HPLC doch eindeutig: High Pleasure Liquid Chromatography…

Peaky und Chromy kurz vor Jahresende – die richtigen Antworten zum „Lügenbuch“ von Peaky

Von HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaky ist dabei, ein HPLC-„Lügenbuch“ zu verfassen. Welche der nachfolgenden Aussagen sind richtig und welche nicht? Hier die Antworten (Hier geht es zu der Ausgangssituation): „Bald wird es HPLC-Säulen aus dem 3D-Drucker geben, dadurch erscheinen 1.000.000 Böden keine Utopie mehr“Nicht unbedingt eine Lüge, Erläuterung: „Getrennt wie gedruckt“ könnte demnächst Realität werden: Es wird damit gerechnet, dass HPLC-Säulen in absehbarer Zeit auf breitet Basis und nicht wie im Moment vereinzelt mithilfe der 3D-Drucker-Technologie „gedruckt“ werden. Durch eine nahezu identische Größe von ≤ 1,5 µm-Teilchen (engste Korngrößenverteilung), deren perfekten Anordnung in der Säule sowie einer nahezu perfekten Säulenhardware wären 1.000.000 Böden keine…

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Peaky und Chromy kurz vor Jahresende…

Von HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Peaks am Feierabend: Chromy, der Gemütliche, genießt seinen Cognac – und die ruhige Zeit vor Weihnachten. Peaky, der seltenst ruhig auf seinem Allerwertesten sitzen kann, marschiert aufgeregt hin und her. Nach einer gewissen Zeit wird sogar Chromy neugierig und fragt mit seiner tiefen, behäbigen Stimme: „Was machst Du denn da eigentlich? Peaky wie aus der Pistole: „Siehst du doch, mir geht´s nicht gut, gar nicht gut, entsetzlich geht´s mir“. „Ja, was hast du denn?“ „Guck´, ich will ein Buch schreiben, ein Lügenbuch; ein Buch, das möglichst viele, viele, viele Lügen enthält. Ich hab´ schon damit angefangen und auch einiges überlegt,…

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Sind ein kleines „Delay Volume“ der Apparatur und/oder ein kleines Volumen der Mischkammer immer „gut“? oder: Was ein Paar „Mikroliterchen“ alles bewirken können…

Von A Fehlersuche, Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Im Zuge der Verbreitung von UHPLC-Geräten warten die Hersteller mit immer kleineren Verweilvolumina (Verweilvolumen, auch: Verzögerungsvolumen, „Delay Volume“, „Dwell Volume“, das ist das Volumen von der Mischkammer bis zur Säule) bzw. Volumina der Mischkammer (35 – ca. 60 µl) auf. Da ist zunächst nichts dagegen einzuwenden. Kleine Volumina können jedoch auch Nachteile mit sich bringen. Dabei denke ich im Moment nicht an eine erhöhte Gefahr für Niederschläge im Falle von starken Puffern. Und auch nicht an eine schlechte Mischungsqualität imfalle von großen Unterschieden in der Viskosität der zu mischenden Lösungsmittel in Kombination mit einem kleinen Volumen der Mischkammer….

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Selektivität „nur“ durch unterschiedliche Wechselwirkungen?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, polare Komponenten, Säulenauswahl

Der Fall Wir haben alle gelernt, dass – außer vielleicht bei der Ausschluss- und der Affinitätschromatographie – eine chromatographische Trennung durch unterschiedliche Wechselwirkungen der zu trennenden Analyte mit der stationären Phase zustande kommt. Dabei werden je nach Mechanismus stark ionische bis stark hydrophobe Wechselwirkungen angenommen. Verteilungsmechanismen sind bei der HILIC ein Thema, sonst finden sie wenig Erwähnung. Sind aber lediglich Wechselwirkungen alles was die Selektivität beeinflusst? Die Lösung Nein. Auch für kleine Moleküle können sterische Aspekte von Bedeutung sein, siehe dazu Abb. 1. Bei der Trennung einer Mischung von Metaboliten von tricyclischen Antidepressiva, also durchaus kleine Moleküle, werden an zwei „polaren“…

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Die Sicht der Dinge… Oder: Selektivität vs. Peaksymmetrie von basischen Komponenten an hydrophoben Phasen

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Säulenauswahl

Nach Durchsicht meiner Notizen habe ich mich für folgendes Beispiel entschieden: Der Fall Habt ihr vor, stark basische Substanzen zu trennen? So, so, dann aber Vorsicht: Nehmt dazu von mir aus eure geliebten, modernen, teueren, sauberen, Metallionen-armen, gut abgedeckten, super endcappten Phasen. In einer Hinsicht habt ihr Recht: Ihr bekommt sicherlich schöne, symmetrische, schlanke Peaks –eine „scharfe“ Trennung eben, siehe Abb. 1. Abb.1 „Trennung“ von Pyridin/Benzylamin, Uracil (inert!), Phenol in einem sauren Phosphatpuffer an einer hydrophoben RP-Phase Seht ihr aber auch alles? Merke: Mit polaren/ionischen Komponenten und hydrophoben Phasen ist Umsicht eine unabdingbare Tugend. Die Lösung Tut mir und euch…

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Die richtige Wellenlänge – „es ist eine alte Geschicht´, doch bleibt sie immer neu“

Von B Optimierung, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Wellenlänge

Der Fall Ich habe wirklich lange mit mir selber gerungen, ob ich diese Trivialität als „HPLC-Tipp“ schreiben soll. Nachdem ich mich jedoch vor kurzem einen halben Tag „dumm und dämlich“ nach verlorenen Peaks gesucht habe und ich sämtliche mir bekannte griechische, deutsche und saarländische Schimpfworte losgeworden bin, wage ich es doch. Meine Lehre daraus ist: Fangen Sie bitte an, eine Trennung zu optimieren oder nach einem Fehler zu suchen erst dann, wenn Sie 100 % sicher sind, dass die eingestellte Wellenlänge optimal beziehungsweise richtig ist. Übertreibe ich vielleicht ein bisschen? Die Lösung Ich denke nein, es sei denn, Sie sind…

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Was ist der Unterschied zwischen Totzeit und Totvolumen, Selektivität und Auflösung?

Von Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps

Der Fall Ich mache immer wieder die Erfahrung, dass eine Reihe von Begriffen im HPLC-Alltag nicht einheitlich benutzt werden. Das führt unweigerlich zu Missverständnissen. Daher mein Anliegen hier, dass wir wenigstens ein Paar dieser Begriffe „sauber“ definieren. Die Lösung Totzeit, to oder tm (Lösungsmittelpeak, Front, Durchbruchszeit, Mobilzeit) ist die Aufenthaltszeit aller Komponenten im Eluenten. Sie ist für alle Komponenten gleich. Anders formuliert: Das ist die Zeit für eine inerte Komponente; inerte Komponente ist eine Komponente, die in alle Poren des Füllmaterials hinein diffundieren kann, aber keine Wechselwirkung mit der stationären Phase eingeht. Eine solche Komponente kann folglich sich nur im…

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Wie kritisch sind Temperaturschwankungen/Temperaturveränderungen? Teil II: Säule, Trennung

Von Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Durch eine Änderung der Trenntemperatur ändern sich die chromatographischen Grö­ßen sowohl in physikalischer (Δ Viskosität => Δ Kinetik => Δ Effizienz) als auch in chemischer/thermodynamischer Hinsicht: Δ Sorptionsenthalpie => Δ Retentionszeit => Δ Selektivität. Somit ist die Temperatur ein chromatographischer Parameter, mit dem die Trennung gezielt verändert werden kann. Wie ist nun der Parameter „Tem­peratur“ konkret zur Trennungsoptimierung einzusetzen? Die Lösung Eine Temperaturerhöhung bewirkt folgendes: Chemie Die Retentionszeit nimmt stets ab (einige chirale Trennungen stellen seltene Ausnahmen dar). Diese Abnahme verläuft für unterschiedliche Substanzen ungleich­mäßig. Somit haben wir eine Änderung der Selektivität. Diese ist z. B. stark ausge­prägt…

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Totzeit, Kapazitätsfaktor, Selektivitätsfaktor . . . Kann man in der Praxis etwas damit anfangen?

Von Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Optimierung, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit

Der Fall Fast in jedem HPLC-Buch wird auf diese Begriffe aus der Theorie der HPLC eingegangen. Fühlt sich jeder Autor irgendwo der HPLC-Theorie verpflichtet oder kann man als „normaler“ Mensch mit diesen Dingen tatsächlich etwas anfangen? Die Lösung Ja, ich denke entschieden ja! Die Reihenfolge einer vernünftigen Vorgehensweise bei der Optimierung in der Sorptions-HPLC lautet prinzipiell: 1) Optimalen k-Bereich einstellen („vernünftige“ Wechselwirkungen/Retention überhaupt) 2) Selektivität verbessern (unterschiedlich stark Wechselwirkungen der zu trennenden Komponenten) 3) Effizienz erhöhen („gute“ Peakform) Aus einem Chromatogramm erkennt man oft, in welchem Stadium der Optimierung man sich befindet. Siehe dazu nachfolgende Tabelle. Der Einfachheit halber gehen…

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