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Wann wird eine „polare“ C18-Phase benötigt?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, polare Komponenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Auf dem Markt gibt es eine Reihe von hydrophoben, gut endcappeden, Metallionen-armen C18- und C8-Phasen eingeführt. Der Vorteil dieser Phasen liegt im Wesentlichen in der guten Chargenreproduzierbarkeit sowie in der hervorragenden Symmetrie für basische Analyten. Darüber hinaus wird eine gute Selektivität für organische Moleküle beobachtet – auch für welche mit polaren Gruppierungen. Sollte nun vor dem Hintergrund dieser handfesten Vorteile eine derartige Phase die erste Wahl bei der Entwicklung einer neuen Methode sein? Die Lösung Nicht unbedingt. Denn für die Trennung bestimmter Analyttypen sind polare Wechselwirkungen notwendig – und zu solchen sind Phasen mit einer ausgesprochen hydrophoben, gut…

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5. Februar 2002

Erhöhung der Effizienz – häufig der schnellere Weg zum Erfolg

Von Apparatur, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Totvolumen

Der Fall Halten wir gleich zu Beginn fest: Der wichtigste, sicherste doch häufig auch aufwendigste Weg zur Verbesserung der chromatographischen Auflösung ( Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis ) ist die Erhöhung der Selektivität. Folgendes Zahlenbeispiel soll dies verdeutlichen: Bei einem Trennfaktor von 1,01 werden 160.000 theoretische Böden benötigt, um zwei Peaks Basislinie-getrennt zu eluieren. Bei einer Verbesserung des Trennfaktors (mit Hilfe vom pH-Wert, Modifier usw.) auf „nur“ 1,05 werden lediglich 6.000 Böden benötigt, bei einer Verbesserung auf 1,10 1.940 Böden und bei einem Trennfaktor von 1,20 gerade 575 Böden. Nochmal: Auch die winzige Verbesserung des Selektivitätsfaktors an der…

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8. November 2001

Spül – und „Waschflüssigkeiten“ für eine HPLC-Anlage

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Bei Bedarf (z. B. Geisterpeaks, Druckerhöhung usw.) sind Teile der Apparatur oder die Apparatur insgesamt zu spülen. Für jeden Zweck bzw. Modul haben sich bestimmte Lösungsmittel/Waschflüssigkeiten gut bewährt. Welche sind das? Wir lassen im Moment die Säule außer Acht, siehe dazu diesen HPLC-Tipp. Die Lösung In der nachfolgenden Tabelle sind einige dieser bewährten Spüllösungen aufgeführt. Abschlussbemerkungen: Unabhängig davon, womit Sie die Anlage gespült haben, sollte bei dem letzten Spülschritt vor dem Verlassen der Anlage für mehr als 2-3 Tage mindestens 40-50 % organisches Lösungsmittel (z. B. Acetonitril) enthalten sein, damit keine Mikroorganismen wachsen können. „Viel hilft viel“- diese…

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10. Oktober 2001

Cut-off von Puffern

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall In der Spurenanalytik stört naturgemäß eine starke UV-Absorption des Eluenten – vor allem im unteren Wellelängenbereich. Es versteht sich von selbst, dass wenn irgendwie möglich Acetonitril und nicht Methanol verwendet werden sollte und dass „Gradient“-Qualität für die Lösungsmittel hier eine Selbststverständlichkeit sein sollte. Nun, ist es leider so, dass praktisch jede Zugabe zum Eluenten ( Modifier, Puffer, Ionenpaarreagenzien usw. ) dessen Eigen-UV-Absorption erhöht. So kann beispielsweise nach der Zugabe von 1% Acetat zum Acetonitril praktisch ab 250 nm aufwärts empfindlich gemessen werden. Wie sieht es nun mit dem cut-off (Wellenlänge unter der man nicht messen kann, da die…

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5. September 2001

Trennung von basischen und sauren Komponenten in einer Probe

Von B Optimierung, HPLC-Tipps

Der Fall Es gibt heute eine Reihe moderner Säulen, die sich hervorragend für die Trennung stark basischer Analyten eignen. Die Trennung starker Säuren dagegen gelingt in der Regel an nicht entcappeden „Klassikern“ gut. Etwas vereinfacht können wir wie folgt festhalten: Man nehme für starke Basen (d.h. dissoziiert vorliegend) : Silanol-arme RP-Phasen mit gut abgedeckter Oberfläche plus alkalischer Eluent, s. jedoch auch diesen Tipp Man nehme für schwächere organische Basen mit ausgeprägtem organischen Charakter (undissoziiert vorliegend): Phasen wie unter „1“ plus saurer Eluent Man nehme für schwächere Säuren (undissoziiert vorliegend): Phasen plus Eluent wie unter „2“ Man nehme für stärkere Säuren…

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8. August 2001

Änderung nur der Peakhöhe bzw. nur der Peakfläche – die Ursachen

Von A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Für den Fall, dass auf ein Mal sowohl die Peakhöhe als auch die Peakfläche sich ändern gibt es eine Reihe von Ursachen, die jeder(m) erfahrenen Kollegin(en) sicherlich geläufig sind: verändertes Injektionsvolumen, instabile Probe, Leckage nach dem Injektor, evtl. Änderung vom pH-Wert (siehe diesen HPLC-Tipp), irreversible Sorption an „hungrigen Oberflächen“ (siehe diesen HPLC-Tipp), Änderung der Wellenlänge. Was bedeutet es aber, wenn nur die Peakhöhe bei konstanter Peakfläche bzw. die Peakfläche bei konstanter Peakhöhe sich ändert? Setzen wir voraus, dass Sie bewusst keine Hardware-Änderung vorgenommen haben, z. B. eine längere Säule oder eine Säule mit kleineren Teilchen eingesetzt. Vorbemerkung: Hier…

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10. Juli 2001

Fehlerquellen bei der Anwendung von Puffern

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Bei der Trennung von ionischen Analyten in der Routine sind gepufferte Eluenten unerlässig. Die Reproduzierbarkeit ist durch ihren Einsatz generell besser. Dennoch gibt es immer wieder Probleme: Mangelnde Stabilität von Retentionszeiten, Änderung der Peakform, geringe Lebensdauer der Säule. Was sind die Ursachen dafür? Die Lösung Denken Sie bitte an folgende Fehlerquellen: Falscher Puffer zu eingestelltem pH-Wert: Z. B. Phosphatpuffer bei pH=5. Zu schwacher Puffer: Z. B. Trennung von starken Basen und Verwendung eines 5 oder 10 mMol-Puffers – 20 mMol wäre „sichererer“. Messung in einem Bereich von +/- 1 pH-Einheit von pKs- Wert der Komponente. Z. B.Trennung von…

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5. Juni 2001

Ein Peak verhält sich „komisch“ – was kann die Ursache sein?

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Fast alle Peaks bei einer Wiederholmessung verhalten sich recht „anständig“, d.h. Retentionszeit, Fläche, Peakform etc. bleiben konstant. Nur ein einziger Peak (oder vielleicht zwei) bereitet Ihnen Kopfschmerzen: Beispielsweise ist er permanent auf Wanderschaft oder er zeigt nicht die Fläche, die er zeigen sollte. Woran kann es liegen? Die Lösung Nachfolgend nenne ich Ihnen einige Ursachen. Die Betonung liegt wirklich auf „einige“, denn besprochenes Problem ist tatsächlich eines der unangenehmsten im HPLC-Alltag. Ich bin sicher, dass erfahrene LeserInnen auf manch weitere Ursache hinweisen könnten. Veränderung der Retentionszeit „Wanderung“ ( nur eines oder weniger Peaks ) deutet auf einen multiplen…

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9. Mai 2001

Optimierung über die Säulenparameter – was „bringt“ was?

Von B Optimierung, Fluss, HPLC-Tipps, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Nehmen wir an, Sie müssen mit einer ganz bestimmten stationären Phase eine isokratische Trennung durchführen. Sie sind an diesem Material gebunden, weil beispielsweise Ihr Rohstoff-Lieferant bereits damit seine Methode validiert hat. Die erste Injektion liefert leider Gottes eine recht „lausige“ Trennung, die zweite auch. Gerät und Sonstiges ist in Ordnung. Sie haben jetzt von Ihrem Chef das OK – nachdem ja die stationäre und auch die mobile Phase „tabu“ sind – nun doch an den physikalischen Säulendaten und an dem Fluss etwas experimentieren zu dürfen. Man könnte folgende Parameter ändern: Säulenlänge vergrößern sowie Fluss, Teilchengröße und Innendurchmesser verkleinern….

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4. März 2001

Sind polare RP-C18-Phasen für die Trennung polarer Analyten besser als apolare?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall In letzter Zeit sind recht viele polare RP-Phasen eingeführt worden. Diese gehören im wesentlichen zu zwei Hauptgruppen: Zum einen sind es hydrophil endcappte Phasen („AQ“,„AQUA“) bzw. Phasen mit einer polaren Gruppe wie Phenyl oder Phenyl-Hexyl und zum anderen welche mit einer polaren Gruppe an der Alkylkette („embedded phases“), einer zusätzlichen positiven Ladung oder mit mehreren Funktionalitäten (Mixed Mode Phasen). Der polare Charakter bei den Letzteren ergibt sich durch die meist kurze Alkylkette (C8, C12, C16) und selbstverständlich durch eine/mehrere polare(n) Gruppe(n), oft Carbamat, Amid oder Harnstoff. Bedeutet nun dies, liebe AnwenderInnen, dass solche Phasen die erste Wahl bei…

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5. Januar 2001