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Muss es immer Kaliumphosphat sein?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Ein beliebter Puffer in der Routine-RP-Chromatographie ist zweifelsohne Kaliumphosphat: Kaliumdihydrogen- für den sauren, Dikaliumhydrogenphosphat für den neutralen/schwach-alkalischen Bereich. Eine Klarstellung vorweg: Wenn Sie mit „Ihrem“ Kaliumphosphatpuffer zufrieden sind, so ändern Sie um Gottes Willen nichts, verfahren Sie weiterhin wie gehabt und schauen Sie sich andere HPLC-Tipps an. Sollten Sie jedoch nicht ganz glücklich sein, so denken Sie vielleicht (sofern Sie etwas ändern dürfen… ) an Ammoniumphosphat, es hat gegenüber Kaliumphosphat einige Vorteile. Welche sind das? Die Lösung Ammoniumphosphat ist in höherer Reinheit erhältlich, dadurch treten bei empfindlichen Gradiententrennungen seltener Störpeaks auf Ammoniumphosphat ist besser löslich, dadurch besteht bei…

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5. Juni 2002

Überprüfung der Peakhomogenität – die etwas aufwendigeren Maßnahmen

By B Optimierung, Eluent, HPLC-Tipps

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns über schnelle Möglichkeiten zur Überprüfung der Peakhomogenität nach einer erfolgten Trennung unterhalten. Dabei blieb des chromatographische System mehr oder weniger unverändert. Heute geht es um etwas aufwendigere Maßnahmen. Die Lösung 1. Änderung des Eluenten Zweifelsohne ist eine pH-Wert-Änderung die effektivste Möglichkeit, die Selektivität von ionischen oder auch von lediglich polaren Analyten zu verändern. Vorschlag: ± 0,5 oder ± 1 pH-Einheit bei sonst konstanten Bedingungen. Als zweite, relativ einfache Möglichkeit wäre folgende zu nennen: Belassen Sie es bei dem ursprünglichen pH-Wert, stellen jedoch jenen mit einer anderen Säure/Base ein, z. B. statt mit…

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9. Mai 2002

Schnelle Überprüfung der Peakhomogenität, Teil 1

By B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung

Der Fall Sie sind an´s Ende einer Trennungsoptimierung angelangt, Ihre Peaks sehen recht anständig aus. Sie stehen nun vor der Frage: „Wie kann ich schnell die Peakhomogenität überprüfen?“ „Schnell“ bedeutet ohne großartige Hardware-Änderung (z. B. Säulenschaltventil einbauen) oder Änderung an der „Chemie“ (z. B. anderer Puffer). Im hiesigen Tipp sowie teilweise in diesem Tipp werden wir uns mit solch einfachen Maßnahmen beschäftigen, deren Realisierung höchstens ein Paar Minuten bis eine viertel Stunde dauert. In diesem Tipp werden wir uns etwas aufwendigere Maßnahmen anschauen. Die Lösung 1. Änderung von Einstellungen Durch Änderung von Einstellungen an der Apparatur wird natürlich nicht die…

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9. April 2002

Reicht das Spülen der Säule mit Wasser bzw. mit Acetonitril aus?

By A Fehlersuche, ACN, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Sie merken es am erhöhten Druck, an plötzlich auftretenden Geisterpeaks, an einer Peakverbreiterung: Sie haben es einfach mit „Dreck“ zu tun, es muss gespült werden. „Spülen in der HPLC“ ist offensichtlich ein stets aktuelles Thema. Jedenfalls wird in HPLC-Veranstaltungen immer wieder die Notwendigkeit und die Effektivität einzelner Spülschritte diskutiert. Eine häufige Frage bei HPLC-Kursen lautet: „Reicht es, wenn ich meinen Puffer und sonstige polare Verunreinigungen mit Wasser und meinen organischen „Dreck“ mit Acetonitril „herunter“ spüle?“ Die Lösung In aller Regel, ja. Wenn man allerdings mit hartnäckigen Verunreinigungen zu tun hat, kann es in der Tat sein, dass die…

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10. März 2002

Wann wird eine „polare“ C18-Phase benötigt?

By B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, polare Komponenten, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Auf dem Markt gibt es eine Reihe von hydrophoben, gut endcappeden, Metallionen-armen C18- und C8-Phasen eingeführt. Der Vorteil dieser Phasen liegt im Wesentlichen in der guten Chargenreproduzierbarkeit sowie in der hervorragenden Symmetrie für basische Analyten. Darüber hinaus wird eine gute Selektivität für organische Moleküle beobachtet – auch für welche mit polaren Gruppierungen. Sollte nun vor dem Hintergrund dieser handfesten Vorteile eine derartige Phase die erste Wahl bei der Entwicklung einer neuen Methode sein? Die Lösung Nicht unbedingt. Denn für die Trennung bestimmter Analyttypen sind polare Wechselwirkungen notwendig – und zu solchen sind Phasen mit einer ausgesprochen hydrophoben, gut…

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5. Februar 2002

Erhöhung der Effizienz – häufig der schnellere Weg zum Erfolg

By Apparatur, Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Totvolumen

Der Fall Halten wir gleich zu Beginn fest: Der wichtigste, sicherste doch häufig auch aufwendigste Weg zur Verbesserung der chromatographischen Auflösung ( Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis ) ist die Erhöhung der Selektivität. Folgendes Zahlenbeispiel soll dies verdeutlichen: Bei einem Trennfaktor von 1,01 werden 160.000 theoretische Böden benötigt, um zwei Peaks Basislinie-getrennt zu eluieren. Bei einer Verbesserung des Trennfaktors (mit Hilfe vom pH-Wert, Modifier usw.) auf „nur“ 1,05 werden lediglich 6.000 Böden benötigt, bei einer Verbesserung auf 1,10 1.940 Böden und bei einem Trennfaktor von 1,20 gerade 575 Böden. Nochmal: Auch die winzige Verbesserung des Selektivitätsfaktors an der…

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8. November 2001

Spül – und „Waschflüssigkeiten“ für eine HPLC-Anlage

By ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Bei Bedarf (z. B. Geisterpeaks, Druckerhöhung usw.) sind Teile der Apparatur oder die Apparatur insgesamt zu spülen. Für jeden Zweck bzw. Modul haben sich bestimmte Lösungsmittel/Waschflüssigkeiten gut bewährt. Welche sind das? Wir lassen im Moment die Säule außer Acht, siehe dazu diesen HPLC-Tipp. Die Lösung In der nachfolgenden Tabelle sind einige dieser bewährten Spüllösungen aufgeführt. Abschlussbemerkungen: Unabhängig davon, womit Sie die Anlage gespült haben, sollte bei dem letzten Spülschritt vor dem Verlassen der Anlage für mehr als 2-3 Tage mindestens 40-50 % organisches Lösungsmittel (z. B. Acetonitril) enthalten sein, damit keine Mikroorganismen wachsen können. „Viel hilft viel“- diese…

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10. Oktober 2001

Cut-off von Puffern

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall In der Spurenanalytik stört naturgemäß eine starke UV-Absorption des Eluenten – vor allem im unteren Wellelängenbereich. Es versteht sich von selbst, dass wenn irgendwie möglich Acetonitril und nicht Methanol verwendet werden sollte und dass „Gradient“-Qualität für die Lösungsmittel hier eine Selbststverständlichkeit sein sollte. Nun, ist es leider so, dass praktisch jede Zugabe zum Eluenten ( Modifier, Puffer, Ionenpaarreagenzien usw. ) dessen Eigen-UV-Absorption erhöht. So kann beispielsweise nach der Zugabe von 1% Acetat zum Acetonitril praktisch ab 250 nm aufwärts empfindlich gemessen werden. Wie sieht es nun mit dem cut-off (Wellenlänge unter der man nicht messen kann, da die…

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5. September 2001

Trennung von basischen und sauren Komponenten in einer Probe

By B Optimierung, HPLC-Tipps

Der Fall Es gibt heute eine Reihe moderner Säulen, die sich hervorragend für die Trennung stark basischer Analyten eignen. Die Trennung starker Säuren dagegen gelingt in der Regel an nicht entcappeden „Klassikern“ gut. Etwas vereinfacht können wir wie folgt festhalten: Man nehme für starke Basen (d.h. dissoziiert vorliegend) : Silanol-arme RP-Phasen mit gut abgedeckter Oberfläche plus alkalischer Eluent, s. jedoch auch diesen Tipp Man nehme für schwächere organische Basen mit ausgeprägtem organischen Charakter (undissoziiert vorliegend): Phasen wie unter „1“ plus saurer Eluent Man nehme für schwächere Säuren (undissoziiert vorliegend): Phasen plus Eluent wie unter „2“ Man nehme für stärkere Säuren…

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8. August 2001

Änderung nur der Peakhöhe bzw. nur der Peakfläche – die Ursachen

By A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Für den Fall, dass auf ein Mal sowohl die Peakhöhe als auch die Peakfläche sich ändern gibt es eine Reihe von Ursachen, die jeder(m) erfahrenen Kollegin(en) sicherlich geläufig sind: verändertes Injektionsvolumen, instabile Probe, Leckage nach dem Injektor, evtl. Änderung vom pH-Wert (siehe diesen HPLC-Tipp), irreversible Sorption an „hungrigen Oberflächen“ (siehe diesen HPLC-Tipp), Änderung der Wellenlänge. Was bedeutet es aber, wenn nur die Peakhöhe bei konstanter Peakfläche bzw. die Peakfläche bei konstanter Peakhöhe sich ändert? Setzen wir voraus, dass Sie bewusst keine Hardware-Änderung vorgenommen haben, z. B. eine längere Säule oder eine Säule mit kleineren Teilchen eingesetzt. Vorbemerkung: Hier…

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10. Juli 2001