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A Fehlersuche

Die Retentionszeit bleibt konstant – ist somit auch der Fluss automatisch OK?

Von A Fehlersuche, Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Fluss, HPLC-Tipps, Pumpe, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Sie stellen fest, dass bei Wiederholinjektionen einer Probe die Retentionszeit konstant bleibt. Bedeutet dies, dass alle Faktoren, die die Retentionszeit beeinflussen können, also – neben Temperatur, Eluent und stationärer Phase – auch der Fluss in Ordnung sind? Die Lösung Bei den drei Erstgenannten zweifelsohne, beim Fluss nicht unbedingt. Erläuterung: Bekanntlich unterscheiden wir bei einer Pumpe zwischen der Langzeit- und der Kurzzeitkonstanz. Wenn die Retentionszeit bei Wiederholinjektionen konstant bleibt, ist die Langzeitkonstanz der Pumpe (also die Streuung des Flusses im Langzeitbereich) in der Tat OK. Daneben gibt es aber auch die Kurzzeitkonstanz der Pumpe: Konstanz des Flusses im Kurzzeitbereich,…

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7. November 2008

Einfluss des Probelösungsmittels auf die Trennung

Von A Fehlersuche, B Optimierung, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Wir haben uns bereits über den Einfluss der Probelösung auf die Peakform und somit auf die Trennung unterhalten. So führt ein zu starkes Probelösungsmittel (Probe z. B. in mehr MeOH oder ACN im Vergleich zum Eluenten) zum Fronting oder gar zu Doppelpeaks, andererseits führt ein schwaches Probelösungsmittel – mehr Wasser im Vergleich zum Eluenten – zur Aufkonzentrierung am Säulenkopf und somit zu einer Verbesserung der Peakform. Die Folge lautet im zweiten Fall: Verbesserung der Auflösung bzw. Erniedrigung der Nachweisgrenze, vor allem bei früh eluierenden Peaks. In letzter Zeit haben wir uns intensiv mit der Injektion befasst und haben…

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7. Oktober 2008

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Uncategorized

Nachfolgend möchte ich gerne diverse Themen ansprechen. Basisliniendrift ACN/TFA (Trifluoressigsäure) ist ein beliebter Gradient in der RP-HPLC. Bei niedrigen Wellenlängen hat man allerdings oft mit einer sehr störenden Drift zu tun und im Falle von kleinen Peaks wird deren Integration dadurch stark erschwert. Abhilfe: Statt der üblichen Konzentration von 0,1% TFA kann man einfach 0,085% TFA verwenden. Vielleicht wird die Selektivität kaum verändert, man stellt jedoch eine wesentlich schwächere Drift fest. Irreversible Sorption an Oberflächen Über dieses leidige Thema haben wir uns des öfteren unterhalten. Dennoch möchte ich es wieder aufgreifen, weil viele Reproduzierbarkeitsprobleme mit der Peakfläche damit zusammenhängen. Und…

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7. August 2008

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, ACN, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel

Probleme, die direkt oder indirekt mit dem Lösungsmittel Acetonitril zu tun haben Fall 1 In einem kleinen Labor, das vom Platz her gar nicht dafür ausgelegt ist, befinden sich 6 HPLC-Geräte. Die KollegInnen dort haben immer wieder Probleme mit Retentionszeitverschiebungen und Reproduzierbarkeitsprobleme bezüglich Peakfläche. Der Grund: Die Klimaanlage schafft es einfach nicht. Im kleinen Raum ist es wegen der Wärmeentwicklung durch die Geräte recht warm. Ergebnis: Unreproduzierbare Herstellung des Eluenten, Verdampfen von Acetonitril, das als Probelösungsmittel verwendet wird und dadurch Aufkonzentrierung der Probelösung. Eine Lösung des Problems ist kurzfristig leider nicht in Sicht. Fall 2 Zwei Labors sollten eine Applikation…

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7. Juni 2008

Nimm Dir die Zeit und lasse Chromatogramme „sprechen“…

Von A Fehlersuche, Auflösung, Bodenzahl, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die Chromatogramme „erzählen“ viel – man sollte sich nur die Zeit nehmen, sie etwas bewusst anzuschauen. Das sei nachfolgend anhand der Chromatogramme der Abbildung 1 demonstriert. Dieses Beispiel stammt von der Arbeitsgruppe Prof. Engelhardt, Saarbrücken. Das obere Chromatogramm wurde mit einer neuen Säule aufgenommen, das zweite nachdem die Säule ein Jahr lang in Methanol/Wasser gelagert wurde. Was fällt auf und wie können wir die Unterschiede erklären? Abb. 1 Die zwei Chromatogramme wurden mit einem Abstand von ca. ein Jahr bei identischen chromatographischen Bedingungen aufgenommen, die Säule war in dieser Zeit in Methanol/Wasser gelagert Die Lösung Es fallen direkt…

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7. April 2008

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Integration, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Variationskoeffizient (Vk)

Der Fall In diesem Peak haben wir uns mit physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigt, die beim Methodentransfer zu unterschiedlichen Flächen (und somit zu unterschiedlichen Gehalten) führen  – trotz technisch einwandfreier Hardware. Hier geht es um Probleme bei der Anwendung der Methode, einmal durch unterschiedliche Zahlenwerte innerhalb der Spezifikationsanforderungen und einmal durch Unterschiede bei den Einstellparametern, sowohl was die Datenaufnahme als auch die Integration betrifft. 1. Spezifikationsanforderungen Betrachten wir als Beispiel folgende Anforderungen in einer Prüfvorschrift: „ pH-Wert des Eluenten 4,5 +/- 0,1 pH-Einheiten, Tailingfaktor des Hauptpeaks kleiner/gleich 1,3, Auflösung R zwischen Hauptpeak und Verunreinigung größer/gleich 1,5“. Im Extremfall – aber immer noch innerhalb…

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7. März 2008

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, kleine Peaks, Methodentransfer, Nachweisgrenze, Probengeber, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Unterschiedliche Peakflächen – und somit unterschiedliche Gehalte – sind leider Gottes nichts Ungewöhnliches beim Methodentransfer. Wir unterstellen, dass durch Gerätequalifizierung in den betreffenden Labors technische Fehler, die zur Änderung der Peakfläche führen könnten, ausgeschlossen werden können: Fluss, Wellenlänge, Injektionsvolumen sind in Ordnung. Der Einfachheit halber gehen wir weiterhin von baugleicher HPLC-Hardware aus. Nun, es gibt für das hier besprochene Problem eine Reihe von Ursachen, an die man zunächst nicht ohne weiteres denken würde. Hier werden wir uns mit eher physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigen, in diesem Tipp geht es dann um Probleme bei der Anwendung der Methode (Auslegung von Spezifikationen…

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7. Februar 2008

Ursachen für Drift

Von A Fehlersuche, ACN, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule, Wellenlänge

Der Fall Drift ist je nachdem zwischen lediglich störend und äußerst ärgerlich. Wann ist nun mit Drift zu rechnen? Die Lösung Nachfolgend werden die häufigsten Ursachen genannt: Isokratische Trennungen Die Temperatur ist nicht konstant. Das Problem ist allerdings nur dann wirklich groß, wenn eine merkliche Temperaturdifferenz zwischen Eluent und Säulenraum herrscht Bei einigen Detektoren wie elektrochemischem Detektor oder Brechungsindexdetektor dauert es recht lange, bis die Basislinie stabil ist Die Säule ist (noch) nicht im Gleichgewicht. Bei komplexen Eluenten (z. B. Puffer mit Ionenpaarreagenzien) oder beim Umspülen auf einen „ganz“ anderen Eluenten kann die Gleichgewichtseinstellung recht lang dauern Langsame Elution von…

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7. September 2007

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, Detektor, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Nachweisgrenze, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche

Besteht Bedarf, das Rauschen zu minimieren (Hinweis von Hans-Joachim Kuss, München)? Man braucht dazu zunächst nur ausrechnen, wie hoch das Rauschen ist. Je nach Anforderung kann anschließend entschieden werden, ob aktuell Handlungsbedarf besteht oder eben nicht. Ein Beispiel dazu: Nehmen wir an, Sie betreiben Nebenkomponenten-Analytik, d.h. Sie haben beispielsweise einen Hauptpeak mit einem Ausschlag von 1V und mehrere kleine Peaks mit einem Reporting Level von 0,05%, was häufig das zweifache der Bestimmungsgrenze beträgt. 0,05% von 1 V – der Ausschlag des Hauptpeaks – sind 500 µV. Als Bestimmungsgrenze wird oft ein S/N-Verhältnis („Signal/Rauschen-Verhältnis“) von 10:1 definiert, im vorliegenden Beispiel sollte also…

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7. August 2007

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized

Kontaminierte Fritten – was bewirken sie? „Hohen Druck!“ kommt aus Ihrem Munde. Natürlich richtig, aber nicht nur. Was noch? Doppelpeaks, wobei der zweite „Peak“ bzw. Aufsetzer sich oft unterhalb der Peakmitte ansetzt, Ergebnis: oft ein tailender „Fuß“ An der verschmutzten Frittenoberfläche kann durch Adhäsionskräfte ein Teil der(s) Analyte(n) irreversibel adsorbiert werden, Ergebnis: kleinere Peakfläche Auch Luftblasen können dort leicht „hängen“ bleiben, Ergebnis: häufige(r) Luftprobleme Durch diese Blockade/Verstopfung erhöht sich lokal der Druck, damit der an der Pumpe eingestellte Fluss tatsächlich weiterhin fließen kann. Dadurch ergibt sich eine etwas höhere Temperatur, Ergebnis: geringe Abnahme der Retentionszeit Spülen mit Methanol Eine RP-Phase…

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7. Juni 2007