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HPLC-Tipps

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Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, ACN, Chromatogramm, Eluent, HPLC-Tipps, Integration, Uncategorized, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Verschiebung der Retentionszeit (2) Im diesem Tipp haben wir uns mit der Verschiebung der Retentionszeit beschäftigt, die Ursachen lagen in einer Veränderung der stationären Phase im Sinne der „Chemie“. Hier werden wir uns Änderungen der mobilen Phase widmen. Auch in diesem HPLC-Tipp geht es um ungewollte Veränderungen, also um solche, die nicht vom Anwender bewusst vorgenommen wurden, z. B. Eluenten-Zusammensetzung oder pH-Wert verändert. Nachfolgend werden einige Gründe für eine veränderte Eluenten-Zusammensetzung genannt. Sie resultieren durch kleine, ungeachtete/unbedachte Variationen beim Ansetzen der mobilen Phase oder während der Trennung. Ein Eluent wird z. B. manchmal dadurch hergestellt, dass der Puffer und die…

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29. Juli 2009

Die „kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Uncategorized, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Hier geht es um eine unerwartete Verschiebung der Retentionszeit, d.h. um eine, die ohne eine bewusste Veränderung seitens des Anwenders erfolgt ist, also: Es wurde keine längere/kürzere/dünnere Säule eingebaut oder die Flussrate geändert. Grundsätzlich liegt in einem solchen Fall eine Verschiebung der Retentionszeit an einer Änderung der Temperatur, der stationären Phase (d.h. „Chemie“ der Oberfläche) und des Eluenten. Ungewollte Temperaturänderung stellt ein eher seltenes Problem dar, deswegen werden wir uns hier zunächst mit der stationären und dann dort mit der mobilen Phase befassen. Veränderung der stationären Phase Bemerkung: Es geht hier um eine Veränderung im Sinne der „Chemie“, d.h. nicht…

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29. Juni 2009

„Trennleistung“, „Effizienz“, „Bandenverbreiterung“ das alles bedeutet doch fast das gleiche – oder?

Von Apparatur, Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Betrachten wir folgende drei Säulen: 250 mm 5 µm, 150 mm 3 µm und 75 mm 1,5 µm. Mit Hilfe der empirischen Formel: Bodenzahl = 3.000 x Länge der Säule in cm durch Teilchengröße in µm stellen wir leicht fest, dass alle drei Säulen – vorausgesetzt sie sind gleich gut gepackt – die gleiche Bodenzahl, nämlich 3.000 x 5 = 15.000 Böden liefern. Sind nun die Säulen wirklich vergleichbar, kann ich also bei gleicher Bodenzahl (15.000 Böden) und völlig identischen chromatographischen und apparativen Bedingungen die gleiche Trennung, sprich die gleiche Auflösung erwarten? Bemerkung: Vorteile der kürzeren Säulen wie…

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29. Mai 2009

Wie kann die Bodenzahl erhöht werden?

Von Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Nachweisgrenze, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Halten wir zunächst folgendes fest: Eine Erhöhung der Selektivität stellt mit Abstand die effektivste Maßnahme dar, um die Auflösung zu verbessern. Folglich sollte diesem Schritt als erstem die ganze Aufmerksamkeit zu Beginn einer Methodenoptimierung geschenkt werden. Wenn jedoch eine Verbesserung der Selektivität mit einem vertretbaren Aufwand nicht zu erzielen ist, wäre die Erhöhung der Bodenzahl der zweitbeste Weg. Welche Möglichkeiten gibt es nun, dies zu erreichen und welche Maßnahme „bringt“ wie viel? Die Lösung In Abb. 1 sind die Möglichkeiten zusammengefasst, die zu einer Erhöhung der Bodenzahl führen. Symbol-Erklärung: N: Bodenzahl R: Auflösung („Resolution“) S/N: Peak/Rausch-Verhältnis („Signal to…

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29. April 2009

Einfluss von Einstellparametern auf die Trennung

Von A Fehlersuche, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, kleine Peaks, Methodentransfer, Nachweisgrenze, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Im diesem Tipp ging es um den Einfluss von Einstellparametern auf die Peakform und damit auch auf die Auflösung. So „verschwinden“ schmale, früh eluierende Peaks bei zu groß eingestellten Werten für die Zeitkonstante (z. B. 0,7-1 s) bzw. zu kleinen Datenraten (z. B. 1-2 Hz). Nun mache ich in Seminaren und Workshops die Erfahrung, dass auch erfahrene Anwender die Brisanz der Einstellparameter unterschätzen. Deswegen greife ich hier das Thema erneut auf und gehe kurz auf den Einfluss der Bandbreite (engl. „bandwidth“) bei einem Dioden Array Detektor auf das chromatographische Ergebnis ein. Die Lösung Abb. 1 Zum Einfluss der…

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29. März 2009

Acetonitril-Knappheit – 1 mm ist viel…

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Eluent, HPLC-Tipps, Lösungsmittel

Der Fall Vor längerer Zeit schon kam unerwartet ein großes Problem auf uns zu: ACN-Knappheit. Da das Problem hinreichend bekannt ist, möchte ich nicht auf Details eingehen, vielmehr wollen wir uns über mögliche Auswege unterhalten, sollte das Problem in einer globalisierten Welt wieder auftauchen. Es ist nicht verkehrt, sich um Lösungsmittelverbrauch in der HPLC im allgemeinen und ACN im speziellen Gedanken zu machen. Welche Möglichkeiten gibt es nun, den ACN-Verbrauch zu vermeiden oder wenigstens zu senken? Die Lösung Nachfolgend werden mögliche Lösungsansätze mit kurzer Stellungnahme/Kommentierung vorgestellt: Auf alternative ACN-Distributoren ausweichen Vielleicht lohnt es sich, gezielte Internet-Recherchen zu starten; so war…

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2. Februar 2009

In wie weit beeinflusst die Probelösung die Auflösung?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Im diesem Tipp haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probelösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit auch auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probelösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Hier möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probelösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probelösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer…

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29. Januar 2009

Der HPLC-Tipp im Dezember

Von HPLC-Tipps, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Achte auf deine Gedanken, denn sie werden deine Worte. Achte auf deine Worte, denn sie werden deine Taten. Achte auf deine Taten, denn sie werden dein Charakter. Achte auf deinen Charakter, denn er wird dein Schicksal. Talmud   Liebe Leserinnen, liebe Leser, ich freue mich immer wieder sehr früh im Jahr auf den Dezember-HPLC-Tipp: Wie Sie wissen, versuche ich zum Jahresausklang Ihnen etwas besonderes anzubieten. So auch in diesem Jahr – ich hatte bereits im August etwas vorbereitet gehabt. Dennoch biete ich Ihnen statt dessen mit Erlaubnis des Autors eine Textpassage aus dem Buch von Jürgen Fuchs „Das Märchenbuch für…

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7. Dezember 2008

Die Retentionszeit bleibt konstant – ist somit auch der Fluss automatisch OK?

Von A Fehlersuche, Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Fluss, HPLC-Tipps, Pumpe, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Sie stellen fest, dass bei Wiederholinjektionen einer Probe die Retentionszeit konstant bleibt. Bedeutet dies, dass alle Faktoren, die die Retentionszeit beeinflussen können, also – neben Temperatur, Eluent und stationärer Phase – auch der Fluss in Ordnung sind? Die Lösung Bei den drei Erstgenannten zweifelsohne, beim Fluss nicht unbedingt. Erläuterung: Bekanntlich unterscheiden wir bei einer Pumpe zwischen der Langzeit- und der Kurzzeitkonstanz. Wenn die Retentionszeit bei Wiederholinjektionen konstant bleibt, ist die Langzeitkonstanz der Pumpe (also die Streuung des Flusses im Langzeitbereich) in der Tat OK. Daneben gibt es aber auch die Kurzzeitkonstanz der Pumpe: Konstanz des Flusses im Kurzzeitbereich,…

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7. November 2008

Einfluss des Probelösungsmittels auf die Trennung

Von A Fehlersuche, B Optimierung, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Wir haben uns bereits über den Einfluss der Probelösung auf die Peakform und somit auf die Trennung unterhalten. So führt ein zu starkes Probelösungsmittel (Probe z. B. in mehr MeOH oder ACN im Vergleich zum Eluenten) zum Fronting oder gar zu Doppelpeaks, andererseits führt ein schwaches Probelösungsmittel – mehr Wasser im Vergleich zum Eluenten – zur Aufkonzentrierung am Säulenkopf und somit zu einer Verbesserung der Peakform. Die Folge lautet im zweiten Fall: Verbesserung der Auflösung bzw. Erniedrigung der Nachweisgrenze, vor allem bei früh eluierenden Peaks. In letzter Zeit haben wir uns intensiv mit der Injektion befasst und haben…

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7. Oktober 2008