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HPLC-Tipps

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Eine/mehrere polare Komponente(n) eluiert(en) direkt an der Totzeit – was tun?

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule

Der Fall Nehmen wir an, Sie können Ihre viele, mehr oder weniger apolare Komponenten recht gut trennen. Nur eine oder zwei Komponente(n) bereitet(n) Ihnen Kopfzerbrechen: Jene polare eluiert(en) direkt beim Totzeitpeak bzw. an der Flanke des an der Totzeit eluierenden polaren „Drecks“. Wie auch immer, gestaltet sich deren Integration als wahres Abenteuer. Wenn Sie nun großartig Gradient, Säule usw. ändern würden, mit dem Ziel diese(n) polare(n) Peak(s) nach hinten zu verschieben, könnte es sein, dass womöglich die Trennung restlicher Peaks sich ändert/verschlechtert und dazu haben Sie logischerweise keine Lust. Was tun? Die Lösung Bauen Sie vor Ihre C18-Säule eine kurze…

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7. November 2007

Wie aussagekräftig ist die Angabe „X % C“ bei einer RP-Phase?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Säule

Der Fall Man findet bei den Angaben zu den physikalisch-chemischen Eigenschaften von RP-stationären Phasen in Datenblättern von Herstellern u. a. gelegentlich auch die Angabe „% C“. Man geht nun davon aus, dass je höher diese Zahl ist (also der Kohlenstoffgehalt der stationären Phase), um so stärker die Belegung und damit auch der hydrophobe Charakter der entsprechenden Phase ist. Stimmt das? Die Lösung Nicht unbedingt! Man muss auch die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Kieselgels in Betracht ziehen – hier zunächst einmal konkret dessen Packungsdichte, siehe dazu Tabelle 1, in der zwei stationäre Phasen von Waters verglichen werden. Bondapak hat zwar mit 9,80%…

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7. Oktober 2007

Ursachen für Drift

Von A Fehlersuche, ACN, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule, Wellenlänge

Der Fall Drift ist je nachdem zwischen lediglich störend und äußerst ärgerlich. Wann ist nun mit Drift zu rechnen? Die Lösung Nachfolgend werden die häufigsten Ursachen genannt: Isokratische Trennungen Die Temperatur ist nicht konstant. Das Problem ist allerdings nur dann wirklich groß, wenn eine merkliche Temperaturdifferenz zwischen Eluent und Säulenraum herrscht Bei einigen Detektoren wie elektrochemischem Detektor oder Brechungsindexdetektor dauert es recht lange, bis die Basislinie stabil ist Die Säule ist (noch) nicht im Gleichgewicht. Bei komplexen Eluenten (z. B. Puffer mit Ionenpaarreagenzien) oder beim Umspülen auf einen „ganz“ anderen Eluenten kann die Gleichgewichtseinstellung recht lang dauern Langsame Elution von…

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7. September 2007

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, Detektor, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Nachweisgrenze, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche

Besteht Bedarf, das Rauschen zu minimieren (Hinweis von Hans-Joachim Kuss, München)? Man braucht dazu zunächst nur ausrechnen, wie hoch das Rauschen ist. Je nach Anforderung kann anschließend entschieden werden, ob aktuell Handlungsbedarf besteht oder eben nicht. Ein Beispiel dazu: Nehmen wir an, Sie betreiben Nebenkomponenten-Analytik, d.h. Sie haben beispielsweise einen Hauptpeak mit einem Ausschlag von 1V und mehrere kleine Peaks mit einem Reporting Level von 0,05%, was häufig das zweifache der Bestimmungsgrenze beträgt. 0,05% von 1 V – der Ausschlag des Hauptpeaks – sind 500 µV. Als Bestimmungsgrenze wird oft ein S/N-Verhältnis („Signal/Rauschen-Verhältnis“) von 10:1 definiert, im vorliegenden Beispiel sollte also…

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7. August 2007

Die „Kleinen“ im Sommer

Von B Optimierung, Fluss, Gradient, HPLC-Tipps, Nachweisgrenze, Optimierung, Uncategorized

Alternativen zu Phosphor- und Trifluoressigsäure Bekanntlich werden für den stark sauren Bereich (pH-Wert um 2-2,5) gerne H3PO4 oder TFA verwendet. Der pH-Wert wird häufig nicht eingestellt, auch auf die Verwendung von Puffern wird verzichtet: Eine mögliche kleine Verschiebung des pH-Wertes ist in diesem recht sauren Bereich nicht tragisch, eine merkliche Verschiebung der Retentionszeit wird selten beobachtet. Nun zeigt sich immer wieder, dass nicht nur der pH-Wert – sicherlich der wichtigste Faktor! – sondern auch die verwendete Säure die Selektivität beeinflussen kann. Man sollte bei Optimierungsversuchen im Sauren beispielsweise neben den üblich verwendeten Säuren Phosphor-, Trifluoressig-, Essig-, und Ameisensäure auch an…

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7. Juli 2007

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Apparatur, HPLC-Tipps, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized

Kontaminierte Fritten – was bewirken sie? „Hohen Druck!“ kommt aus Ihrem Munde. Natürlich richtig, aber nicht nur. Was noch? Doppelpeaks, wobei der zweite „Peak“ bzw. Aufsetzer sich oft unterhalb der Peakmitte ansetzt, Ergebnis: oft ein tailender „Fuß“ An der verschmutzten Frittenoberfläche kann durch Adhäsionskräfte ein Teil der(s) Analyte(n) irreversibel adsorbiert werden, Ergebnis: kleinere Peakfläche Auch Luftblasen können dort leicht „hängen“ bleiben, Ergebnis: häufige(r) Luftprobleme Durch diese Blockade/Verstopfung erhöht sich lokal der Druck, damit der an der Pumpe eingestellte Fluss tatsächlich weiterhin fließen kann. Dadurch ergibt sich eine etwas höhere Temperatur, Ergebnis: geringe Abnahme der Retentionszeit Spülen mit Methanol Eine RP-Phase…

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7. Juni 2007

Schnelle Methodenentwicklung in der RP-HPLC

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Sie müssen eine Methode schnell entwickeln und Sie haben wenig Zeit. Selbstverständlich verfügen Sie über eine moderne Gradientenanlage und über ein ansehnliches Säulen-Portfolio. Was wäre nun eine sinnvolle, ökonomische Vorgehensweise, um die Methode wenigstens grob entwickeln zu können? Die Lösung Hardware-Voraussetzung: Sollten Sie über eine Niederdruck-Gradientenanlage mit PDA verfügen, benötigen Sie lediglich ein 6-Säulenschaltventil, imfalle eines Hochdruck-Gradienten zusätzlich ein Eluentenschaltventil. Das Konzept Bekanntlich hängt die Selektivität von der stationären Phase, von dem Eluenten (inkl. Gradient) und von der Temperatur ab, wobei zunächst die zwei Erstgenannten in Frage kommen. Stationäre Phase bedeutet „Chemie“ der Oberfläche (also, polarer/hydrophober Charakter der…

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7. Mai 2007

RP-HPLC bei extremen pH-Werten

Von ACN, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Lösungsmittel, Optimierung, pH-Wert des Eluenten, Robustheit

Der Fall Nehmen wir an, die beste Selektivität erzielen Sie bei einem pH-Wert von ca. 1,5-2 bzw. 9-10. Ihre Säule ist in diesem Fall in der Regel nicht sonderlich begeistert: Im Sauren besteht die Gefahr der Abspaltung der funktionellen Gruppe(n) durch Hydrolyse („Bluten“ der Säule) – jene Gefahr ist um so größer je kürzer/polarer die funktionelle(n) Gruppe(n) ist/sind. Im Alkalischen kann das Kieselgel sich auflösen. Was tun nun, um die Lebensdauer der Säule zu verlängern? Die Lösung Nachfolgend stichwortartig einige Empfehlungen für beide Fälle: 1. Arbeiten im Sauren Säule: Verwenden Sie möglichst Zorbax SB oder eine Hybrid-Säule (siehe weiter unten)…

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7. April 2007

Vor- und Nachteile des Detektors CAD Corona

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, HPLC-Tipps

Der Fall Seit Längerem gibt es bereits den Detektor CAD Corona (Corona Aerosol Detektor) auf dem Markt und es existieren schon fundierte Erfahrungen aus seinem Einsatz. Es soll hier nicht auf seine Funktionsweise und seine Besonderheiten eingegangen werden, jene sind in dem Info-Material der Anbieter gut und übersichtlich beschrieben. Nachfolgend sollen vielmehr die Erfahrungen aus Anwendersicht kurz zusammengefasst werden. Die Chromatogramme und die vorgestellten Testergebnisse hat Dirk Mautner, Bayer Bergkamen, freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Lösung Folgende Anwendungsgebiete wären aus Sicht des Test-Labors in Bergkamen zu erwähnen: Routine-Analytik (Gehalts- und Reinheitsbestimmung von Wirk- und Rohstoffen sowie Zwischenprodukten) auch mittels 100%…

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7. März 2007

Sind hydrophobe oder polare Wechselwirkungen für meine Trennung notwendig?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Säulenauswahl, Stationäre Phase

Der Fall Bekanntlich können in der HPLC, je nach Analyt und chromatographische Bedingungen, hydrophobe Wechselwirkungen dominieren oder aber es liegt ein Mischmechanismus vor. Letzteres bedeutet in aller Regel, es sind zusätzliche polare oder gar ionische Wechselwirkungen wirksam. Sterische Aspekte, die auch für kleine Moleküle eine Rolle spielen können, lassen wir hier außer acht. Nun stellt sich die Frage erstens, wann herrschen vorwiegend eher hydrophobe oder eher polare Wechselwirkungen und zweitens, welche sollte ich wann, wie begünstigen? Die Lösung Hier angesprochenes Thema ist ein sehr Komplexes und es bedarf eines nicht unbeträchtlichen Umfangs, wollte man jenes genauer behandeln. Dennoch sind aus…

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7. Januar 2007