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Veränderung der Retentionszeit

Warum verschiebt sich der pH-Wert trotz richtigem Puffer und ausreichender Pufferkapazität?

Von A Fehlersuche, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten mit einem RP-System und folgendem Eluenten: MeOH (oder Acetonitril)/ Kaliumdihydrogen-Phosphatpuffer, pH = 7,5, 45/55 (v/v) und trennen basische Substanzen. Die Trennung ist gut, viel zu gut. Also erhöhen sie – um Zeit zu gewinnen – den Methanolanteil auf 80 % oder Sie fahren einen 40 → 80 % MeOH-Gradienten bei sonst gleichen Bedingungen … und Sie verstehen die Welt nicht mehr: Die Basen kommen nicht einfach früher wie es sich gehört. Nein, alle oder ein Teil davon macht riesige Retentionszeit-Sprünge nach hinten und/oder die Selektivität ändert sich und/oder die Säule hält nicht mehr so lange und so…

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7. März 2000

Miniaturisierung ja – aber was ist in der Routine wirklich machbar und sinnvoll?

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Peakverbreiterung, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Miniaturisierung ist aus wirtschaftlichen und analytischen Gründen häufig ein vernünftiger Ansatz. Was ist nun mit einem „normalen“ Gerät machbar und wann lohnt es sich? Die Lösung Vorbemerkung Für folgende Fälle kann ich die Skepsis mancher Kollegen gegenüber Miniaturisierung nachvollziehen und teilweise sogar teilen: Stark regulierte Umgebung, matrixbelastete Proben und/oder große Anzahl an Komponenten, keine HPLC-Spezialisten in Routine-/Betriebslabors, knappe Zeit, um auftretenden Fehlern nachzugehen, usw.. Das bedeutet keinesfalls, dass in solchen Fällen Miniaturisierung nicht sinnvoll ist, es heißt nur, dass vor einer „Ja/Nein“-Entscheidung eine nüchterne Analyse mit objektiven und belegbaren Vor-/Nachteilen unabdingbar ist, z. B: Was gewinne ich an…

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14. Dezember 1999

Sind 40 °C gleich „40 °C“?

Von Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine Retentionszeitverschiebung hat mehrere Gründe, darüber haben wir uns häufiger unterhalten. Einer der Gründe ist eine Differenz bei der aktuellen Trenntemperatur. So weit so gut. Sie übernehmen nun eine Methode mit der Angabe „40 °C“ und stellen dementsprechend Ihren Säulenofen auf 40 °C ein. Stellen Sie nun fest, dass die Retentionszeit sich etwas verschoben hat, so würden Sie kaum eine Temperaturdifferenz als Ursache annehmen, die Temperatur-Anzeige ist ja in Ordnung und das Gerät ist qualifiziert! Tun Sie mir und Ihnen den Gefallen und seien Sie hier etwas vorsichtig. Jetzt fragen Sie sich, „ist denn 40 °C nicht gleich…

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10. August 1999

Systematische Vorgehensweise beim Auftreten von Problemen

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie arbeiten im Routinelabor und stehen immer wieder vor Problemen. Natürlich wäre optimal, wenn Sie sofort die Lösung hätten. Sofort-Lösungen zu erhalten ist jedoch äußerst selten im Leben und konkrete Tipps bekommen Sie (vielleicht) beim Studium von Fachbüchern, von erfahrenen KollegInnen oder im Rahmen von Weiterbildungsveranstaltungen. Nachfolgend schlage ich Ihnen ein Strategie-Schema vor, wie man vorgehen kann. Auch wenn es auf den ersten Blick theoretisch und recht allgemein erscheinen mag, hilft eine solche oder ähnliche systematische Vorgehensweise sehr. Diagnose von und Umgang mit HPLC-Fehlern Problem wiederholbar? Wann tritt das Problem auf? Nur freitags, nur bei mir usw? Symptome…

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9. Mai 1999

Je älter desto besser: Beim Portwein sicher, beim Rotwein vielleicht – und bei einer C18-Säule?

Von Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die Erfahrung lehrt, dass mit der Zeit die Qualität einer HPLC-Säule abnimmt, die Peaks werden breiter. Ist auch der umgekehrte Fall denkbar? Die Lösung Ja. Halten wir nun folgendes fest: Die Aussage, „die C18-Säule ist schlechter geworden“ kann zweierlei bedeuten. Zum einen kann es sich um eine mechanische Beanspruchung der Packung handeln, deren Ausmaß im wesentlichen von dem Fluss, dem Druck, der Temperatur, der Anzahl der Injektionen und dem Betriebsmodus (isokratischer-/Gradientenbetrieb) abhängt. Lässt nun die Qualität der Packung nach, so manifestiert sich dies mit Peakverbreiterung und/oder Tailling, evtl. sogar mit Doppelpeaks – die Retentionszeit bleibt dabei konstant. Zum…

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4. März 1999

Was ändert sich am Chromatogramm, wenn das Totvolumen einer isokratischen Anlage größer ist als bei einer anderen?

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Eine isokratische Methode soll auf ein anderes Gerät übertragen werden; die aktuelle Apparatur weist ein um 100 μl größeres Totvolumen auf, als die Apparatur, an der die Methode entwickelt wurde. Muss man mit merklichen Unterschieden im Chromatogramm rechnen und wenn ja mit welchen? Die Lösung Ein Totvolumen führt bekanntlich zu Peakverbreiterung, die Auflösung wird schlechter evtl. sogar unzureichend bei früh eluierenden, kritischen Peaks. Was kann noch passieren? Die Retentionsfaktoren (k-Werte, relative Retention) nehmen auch ab. Erläuterung: Es gilt: k Retentionsfaktor (früher: Kapazitätsfaktor, k‘) tR Retentionszeit einer Komponente tm Totzeit (Retentionszeit einer inerten Komponente) Durch eine Vergrößerung des Totvolumens…

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10. Januar 1999

Die Peaks kommen mit der neuen, „identischen“ Säule später – warum?

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie haben eine neue Säule bestellt, die soeben angekommen ist. Obwohl Sie die gleiche Säule (stationäre Phase und Säulendimensionen) bestellt haben, und Sie dem Lieferanten auch treu geblieben sind, kommen die Peaks trotz konstant gehaltener chromatographischer Bedingungen später. Warum? Die Lösung Nehmen wir an, dass die chromatographischen Bedingungen (Temperatur, Eluent incl. pH-Wert, Pufferstärke usw. ) und auch die Probenvorbereitung tatsächlich konstant geblieben sind. Überprüfen Sie nun, ob die Totzeit (Frontpeak, Durchbruch) auch später eluiert. Ist das der Fall, dann ist wahrscheinlich der Fluss nicht mehr konstant: Schauen Sie nach Luft in der Pumpe bzw. nach einer Leckage. Stellen…

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14. August 1998

Ungewollte pH-Verschiebung – die Konsequenzen

Von A Fehlersuche, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die unbeabsichtigte pH-Verschiebung im Eluenten ist einer der häufigsten Gründe für mangelnde Robustheit in der RP-Chromatographie. In diesem HPLC-Tipp geht es um die Ursachen für eine pH-Verschiebung sowie über das Ausmaß. Hier wollen wir uns etwas genauer mit der Änderung der Peakgröße befassen. Die Lösung Eine pH-Wert-Verschiebung kann zu unterschiedlicher Signalgröße (Peakfläche) führen, denn die UV-Absorption polarer Komponenten kann pH-Wert abhängig sein. In Abb. 1 wird das Spektrum der L-Ascorbinsäure bei unterschiedlichen pH-Werten gezeigt. Betrachten wir den pH-Wert-Bereich, der für die HPLC relevant ist, pH = 2-9. Im Alkalischen hätten wir beispielsweise bei 240 nm einen kleinen Peak,…

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7. Juni 1998

Zusätze im Eluenten

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Bei der Herstellung von Eluenten werden immer wieder bestimmte Zusätze (Additiva, „Modifier“) verwendet. Das sind kleine Mengen bestimmter Substanzen – in der Regel im Promille- oder im unteren Prozentbereich -, die einem meist binären Eluenten zugesetzt werden. Wann ist dies notwendig und was bewirken diese Zusätze? Die Lösung Die HPLC-Trickkiste ist unerschöpflich. Die Hauptziele dabei sind: eine bessere Peakform und eine Änderung der Selektivität. Nachfolgend finden Sie in tabellarischer Form für häufige Anwendungen bewährte Zusätze. Häufige Zusätze im Eluenten Das Fazit Kleine Zusätze haben oft eine große Wirkung. In Hinsicht auf Robustheit beachten Sie bitte jedoch folgendes: Nach…

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8. Juli 1997

Spikes im Chromatogramm

Von A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ihre Chromatogramme sehen recht anständig aus, doch ärgern Sie sich immer wieder über auftretende Spikes. Dies sind kleinere oder größere Striche, die häufig an verschiedenen Stellen im Chromatogramm erscheinen. Welche Ursachen können dafür verantwortlich sein und was kann man dagegen tun? Die Lösung Die Hauptursachen für Spikes sind: Luftblasen, Detektor, Elektronik, „Sonstiges“. Schauen wir uns die einzelnen Ursachen etwas genauer an. Luftblasen Einfacher Beweis für Luftblasen in der Pumpe (Δ tR): Wenn Sie die Pumpe ausschalten, sind auch die Spikes weg. Luftblasen im Detektor (Luftbläschen aus dem Eluenten direkt nach der Säule, „Ausgasen“) ergeben eine „unmögliche“ Basislinie, die…

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9. Februar 1997