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Veränderung des Chromatogramms

Unterschiede von HPLC- und UPLC/UHPLC-Trennungen

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Seit Anfang der 2000er (Waters 2004) Jahren werden UHPLC-Geräte eingesetzt. Man könnte nun vereinfacht annehmen, es handele sich dabei um „normale“ HPLC-Geräte, die lediglich so konzipiert sind, dass sie eben hohe Drücke ermöglichen. Das Ergebnis lautet: Merkliche Reduktion der Analysenzeit und des Lösungsmittelverbrauchs, sowie – wegen der kleinen verwendeten Teilchen und der damit verbundenen hohen Bodenzahlen – Verbesserung der Auflösung. Zweifelsohne sind dies aus Anwendersicht die wichtigsten Unterschiede/Vorteile gegenüber klassischen HPLC-Trennungen. Beim Methodentransfer jedoch von HPLC- auf UHPLC-Trennungen sollte man auch an manch eine Besonderheit der UHPLC denken. Damit meine ich nicht bekannte Tatsachen wie peinliche Vermeidung von…

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7. Mai 2008

Nimm Dir die Zeit und lasse Chromatogramme „sprechen“…

Von A Fehlersuche, Auflösung, Bodenzahl, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die Chromatogramme „erzählen“ viel – man sollte sich nur die Zeit nehmen, sie etwas bewusst anzuschauen. Das sei nachfolgend anhand der Chromatogramme der Abbildung 1 demonstriert. Dieses Beispiel stammt von der Arbeitsgruppe Prof. Engelhardt, Saarbrücken. Das obere Chromatogramm wurde mit einer neuen Säule aufgenommen, das zweite nachdem die Säule ein Jahr lang in Methanol/Wasser gelagert wurde. Was fällt auf und wie können wir die Unterschiede erklären? Abb. 1 Die zwei Chromatogramme wurden mit einem Abstand von ca. ein Jahr bei identischen chromatographischen Bedingungen aufgenommen, die Säule war in dieser Zeit in Methanol/Wasser gelagert Die Lösung Es fallen direkt…

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7. April 2008

Eine/mehrere polare Komponente(n) eluiert(en) direkt an der Totzeit – was tun?

Von B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule

Der Fall Nehmen wir an, Sie können Ihre viele, mehr oder weniger apolare Komponenten recht gut trennen. Nur eine oder zwei Komponente(n) bereitet(n) Ihnen Kopfzerbrechen: Jene polare eluiert(en) direkt beim Totzeitpeak bzw. an der Flanke des an der Totzeit eluierenden polaren „Drecks“. Wie auch immer, gestaltet sich deren Integration als wahres Abenteuer. Wenn Sie nun großartig Gradient, Säule usw. ändern würden, mit dem Ziel diese(n) polare(n) Peak(s) nach hinten zu verschieben, könnte es sein, dass womöglich die Trennung restlicher Peaks sich ändert/verschlechtert und dazu haben Sie logischerweise keine Lust. Was tun? Die Lösung Bauen Sie vor Ihre C18-Säule eine kurze…

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7. November 2007

Ursachen für Drift

Von A Fehlersuche, ACN, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms, Vorsäule, Wellenlänge

Der Fall Drift ist je nachdem zwischen lediglich störend und äußerst ärgerlich. Wann ist nun mit Drift zu rechnen? Die Lösung Nachfolgend werden die häufigsten Ursachen genannt: Isokratische Trennungen Die Temperatur ist nicht konstant. Das Problem ist allerdings nur dann wirklich groß, wenn eine merkliche Temperaturdifferenz zwischen Eluent und Säulenraum herrscht Bei einigen Detektoren wie elektrochemischem Detektor oder Brechungsindexdetektor dauert es recht lange, bis die Basislinie stabil ist Die Säule ist (noch) nicht im Gleichgewicht. Bei komplexen Eluenten (z. B. Puffer mit Ionenpaarreagenzien) oder beim Umspülen auf einen „ganz“ anderen Eluenten kann die Gleichgewichtseinstellung recht lang dauern Langsame Elution von…

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7. September 2007

Symptome und Ursachen in der Routine-HPLC

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Änderungen im Chromatogramm einer Routine-Methode können bestimmten Ursachen zugeschrieben werden. Eine Zuordnung ist natürlich nicht immer einfach bzw. eindeutig. Die bewusste Wahrnehmung der Korrelation jedoch zwischen Symptom und Ursache hilft bei der Eingrenzung von mehreren, möglichen Ursachen. Beschränken wir uns hier auf die häufigsten Fälle, desweiteren setzen wir voraus, dass seitens des(r) Anwenders(in) keine Hardware- oder sonstige Änderung bewusst vorgenommen wurde, z. B. eine längere Säule oder eine längere/dünnere Kapillare eingebaut. Die Lösung In Tab. 1 sind auf der linken Spalte häufige Symptome und auf der rechten Seite mögliche Ursachen aufgeführt. Δ : Änderung F : Fluss tm…

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7. Juni 2005

Von 100% wässriger zu 100% organischer Phase – mögliche Probleme bei Gradientenläufen

Von A Fehlersuche, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Manche AnwenderInnen arbeiten im Gradienten-Modus mit vorgemischten Eluenten, manche legen jeweils 100% A (z. B. Puffer) und 100% B (z. B. ACN) vor und lassen das Gerät die gewünschte Mischung herstellen. Mit nicht-vorgemischten Eluenten kann es zu Problemen kommen, welche wären das und warum? Die Lösung Wenn 100% Puffer und 100% ACN zusammengeführt werden, besteht die Gefahr, dass in dünnen Kapillaren Salze ausfallen (z. B. ab ca. 85% ACN und mehr als 30-30 Mmol Puffer) Wird ein Gradient von 100% A auf 100% B gefahren, herrscht nicht nur der beabsichtigte Lösungsmittelgradient, sondern gleichzeitig ein pH-Wert- und ein Salzgradient….

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7. November 2004

Schlussfolgerungen aus Veränderungen eines Chromatogramms im Routinebetrtieb

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Das Chromatogramm ist ein Bild – vielleicht nicht gerade mit tausend aber dennoch – mit vielen Worten. Aus manch einem Symptom/einer Veränderung des Chromatogramms im Routinebetrieb können einige Ursachen erkannt werden. Hier ist die Rede ist davon, dass der(die) Anwender(in) bewusst nichts geändert hat, d.h. keine Säule ausgewechselt, keinen neuen Eluenten angesetzt, die Anlage läuft über Nacht usw. Des weiteren unterhalten wir uns hier über einfache, isokratische RP-Trennungen. Welche typische Erscheinungen können nun helfen, um Ursachen schnell zu erkennen? Die Lösung In Tab. 1. haben wir in der linken Spalte 15 typische Situationen, also Veränderung eines oder mehrere…

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1. Januar 2004

Änderung nur der Peakhöhe bzw. nur der Peakfläche – die Ursachen

Von A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Für den Fall, dass auf ein Mal sowohl die Peakhöhe als auch die Peakfläche sich ändern gibt es eine Reihe von Ursachen, die jeder(m) erfahrenen Kollegin(en) sicherlich geläufig sind: verändertes Injektionsvolumen, instabile Probe, Leckage nach dem Injektor, evtl. Änderung vom pH-Wert (siehe diesen HPLC-Tipp), irreversible Sorption an „hungrigen Oberflächen“ (siehe diesen HPLC-Tipp), Änderung der Wellenlänge. Was bedeutet es aber, wenn nur die Peakhöhe bei konstanter Peakfläche bzw. die Peakfläche bei konstanter Peakhöhe sich ändert? Setzen wir voraus, dass Sie bewusst keine Hardware-Änderung vorgenommen haben, z. B. eine längere Säule oder eine Säule mit kleineren Teilchen eingesetzt. Vorbemerkung: Hier…

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10. Juli 2001

Optimierung über die Säulenparameter – was „bringt“ was?

Von B Optimierung, Fluss, HPLC-Tipps, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Nehmen wir an, Sie müssen mit einer ganz bestimmten stationären Phase eine isokratische Trennung durchführen. Sie sind an diesem Material gebunden, weil beispielsweise Ihr Rohstoff-Lieferant bereits damit seine Methode validiert hat. Die erste Injektion liefert leider Gottes eine recht „lausige“ Trennung, die zweite auch. Gerät und Sonstiges ist in Ordnung. Sie haben jetzt von Ihrem Chef das OK – nachdem ja die stationäre und auch die mobile Phase „tabu“ sind – nun doch an den physikalischen Säulendaten und an dem Fluss etwas experimentieren zu dürfen. Man könnte folgende Parameter ändern: Säulenlänge vergrößern sowie Fluss, Teilchengröße und Innendurchmesser verkleinern….

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4. März 2001

Peaks kommen zu spät – was tun?

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Optimierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie haben eine Trennung mit einer guten Auflösung erzielt. Die nächste Frage könnte (sollte!) wie folgt lauten: „Wie kann ich am unproblematischsten die Analysenzeit verkürzen?“ Die Lösung Ganz einfach: Fluss erhöhen. Es ist mir bewusst, dass vielen LeserInnen diese Antwort recht banal erscheint. Im Grunde genommen ist sie es auch. Dennoch macht es Sinn darauf hinzuweisen, denn es existieren für meine Begriffe weltweit einfach viel zu viele Prüfvorschriften mit „Fluss: 1 ml/min“. Eine Flusserhöhung führt stets zu Zeitersparnis oder beim Gradienten sogar zur Verbesserung der Auflösung (siehe weiter unten), die Nachteile, die man sich einhandelt, sind gering –…

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8. Oktober 2000