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C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLC-MS-KopplungMethodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

LC-MS-Kopplung – Matrix-Einfluss, das Problem der Empfindlichkeit

Der Fall Die LC-MS-Kopplung wird naturgemäß – abgesehen von Spezialfällen wie z. B. LC-MS als „Peakseparator“ für Fraktionierungen in der präparativen HPLC – zur Überprüfung der Peakhomogenität und zur Substanzidentifizierung eingesetzt. Dies geschieht häufig im Spurenbereich, z. B. Zersetzungs- und Nebenprodukte, Metabolite, unbekannte Verunreinigungen (Target/Non-Target-Analytik). In solchen Fällen gilt, jeglichen Verlust an Empfindlichkeit zu vermeiden. Welche Möglichkeiten gibt es nun dafür? Die Lösung Nachfolgend sind einige Hinweise stichwortartig aufgelistet. Matrix Überprüfen Sie eine evtl. Ionisationsunterdrückung durch die Matrix: Eine Standardlösung wird mit Hilfe einer zweiten Pumpe und eines T-Stückes dem Eluenten nach der Säule zudosiert. Nachdem die Basislinie konstant ist,...
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7. September 2004
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLC-MS-KopplungMethodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung

LC-MS-Kopplung – wie mache ich aus einer HPLC- eine LC-MS-Methode?

Vorbemerkung Die LC-MS-Kopplung wird immer wichtiger. War diese Technik noch Anfang der 2000er Jahre eine Rarität von und für Spezialisten, wird sie zunehmend zu einer Notwendigkeit in Entwicklungslabors, auch in der Routine gewinnt sie an Bedeutung: Routine-LC-MS-Geräte sind in der Zwischenzeit günstig, kompakt, robust und arbeiten recht zuverlässig. Aus diesem Grunde habe ich mich entschlossen, auf einige der häufigsten Fragen, die mir bzgl. LC-MS gestellt werden, in hiesigen sowie in diesem und in diesem HPLC-Tipp in komprimierter Form und aus praktischer Sicht einzugehen. Selbstverständlich bedarf es für eine detaillierte Auseinandersetzung mit dieser Technik des Besuchs entsprechender Seminare bzw. des Studiums von Infomaterial...
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7. August 2004
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippspH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)pH-Wert des EluentenRobustheitVeränderung der Retentionszeit

Überprüfung der Robustheit von Systemen mit gepufferten Eluenten

Der Fall Je komplexer der Mechanismus bei der Wechselwirkung eines Analyten mit der stationären Phase ist, um so labiler sind die Gleichgewichte, um so anfälliger ist die Methode. Mit anderen Worten: Die Robustheit in solchen Systemen ist ein durchaus kritischer Punkt. Es ist sicherlich bekannt, dass im Rahmen der Überprüfung der Robustheit von Methoden mit gepufferten Eluenten u.a. auch der pH-Wert im relevanten Bereich variiert werden sollte. Wie kann man hier ökonomisch vorgehen? Die Lösung Besorgen Sie sich die pKs-Werte Ihrer Substanzen! Wenn diese nicht vorliegen, lohnt es sich schon beim Auftraggeber nachzufragen oder bei Bedarf jene mit Hilfe der...
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7. Juli 2004
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Passivieren mit Salpetersäure – Details und Hinweise

Der Fall Passivieren mit 6 N HNO3 ist ein altes, bewährtes Mittel, um erstens die Anlage gründlich zu reinigen und zweitens die Oberfläche von Stahl (Pumpe, Kapillaren etc. ) zu passivieren – also praktisch inert zu machen. Ich höre jedoch bei Seminaren oder vor Ort häufiger Klagen, wie: „Nachher hat nichts mehr funktioniert, wir mussten sämtliche Dichtungen auswechseln“, „Das Neutralspülen hat 3 Tage gedauert“, „Wir hatten nach der Behandlung mit der Salpetersäure jede Menge Geisterpeaks gehabt“ und vieles dergleichen. Das ist alles richtig und diese Probleme treten tatsächlich auf, wenn bestimmte Sachen nicht beachtet werden. Was wären das? Die Lösung...
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7. Juni 2004
A FehlersucheApparaturFlussFrittenHPLC-Tipps

Bei kleinem Fluss keine Probleme, bei erhöhtem schon – was kann die Ursache sein?

Der Fall Sie arbeiteten bis dato beispielsweise bei einem Fluss von 0,8 mL/min und hatten keine Probleme mit Luftblasen. Nachdem nun die (einfache) Trennung Ihnen zu lange dauert, beschließen Sie nach dem OK Ihres Chefs den Fluss auf 1,2 oder 1,5 mL/min zu erhöhen. Sie bekommen allerdings jetzt permanent Ärger mit Luftblasen. Wieso? Die Lösung Auch ein gut entgaster Eluent enthält stets etwas Luft. So lange nun die Luft im Eluenten bleibt, stört sie nicht. Wenn allerdings der Eluent durch eine enge Stelle fließen muss, entstehen dort Kavitate und im Bereich dieses partiellen Vakuums kann die Luft inform von kleinen...
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7. Mai 2004
B OptimierungHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungOptimierungpH-Wert des EluentenSäulenauswahlStationäre Phase

Trennung von sauren Komponenten mittels RP-HPLC

Der Fall Die Trennung von basischen ist ein viel, viel schwierigeres Unterfangen als die Trennung von sauren Komponenten. Letzteres Trennproblem ist – stark vereinfacht formuliert – fast ein Kinderspiel. Wie geht nun das „Spiel“? Die Lösung Wir unterhalten uns zunächst über den Eluenten: Der wichtigste Parameter ist mit Abstand der pH-Wert, je nach Stärke der zu trennenden Säuren sollte er sich zwischen ca. 1,5 und 4,0 bewegen. Mit seiner Hilfe können die sauren Komponenten neutralisiert werden, oder allgemein formuliert, deren Ionisierungszustand und damit die Wechselwirkung mit der stationären Phase beeinflusst werden. Der Einsatz von Puffern ist grundsätzlich richtig und sinnvoll,...
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7. April 2004
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseDichtungenHPLC-Tipps

Dichtungen in der HPLC – was ist hier wichtig?

Der Fall Nach den Säulen und noch vor der Detektorlampe unterliegen Dichtungen dem größten Verschleiß in der HPLC. An welche Dinge sollte man hier denken, was ist wichtig? Die Lösung Folgende Sachen erachte ich als erwähnenswert: Dichtungen brauchen – wenn sie neu sind – eine gewisse Zeit, bis sie in Acetonitril-haltigen Eluenten ihren End-Quellzustand erreicht haben. Also: Wenn Sie Dichtungen auswechseln und wenn Sie mit ACN/H2O oder ACN/Puffer als Eluent arbeiten, sollten Sie das Gerät eine Zeit lang laufen lassen, bevor Sie mit der eigentlichen Messung beginnen. Ihre Ergebnisse werden einfach präziser. Oder aber sie bewahren Ihre Dichtungen in Acetonitril...
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1. Februar 2004
A FehlersucheChromatogrammHPLC-TippsVeränderung des Chromatogramms

Schlussfolgerungen aus Veränderungen eines Chromatogramms im Routinebetrtieb

Der Fall Das Chromatogramm ist ein Bild – vielleicht nicht gerade mit tausend aber dennoch – mit vielen Worten. Aus manch einem Symptom/einer Veränderung des Chromatogramms im Routinebetrieb können einige Ursachen erkannt werden. Hier ist die Rede ist davon, dass der(die) Anwender(in) bewusst nichts geändert hat, d.h. keine Säule ausgewechselt, keinen neuen Eluenten angesetzt, die Anlage läuft über Nacht usw. Des weiteren unterhalten wir uns hier über einfache, isokratische RP-Trennungen. Welche typische Erscheinungen können nun helfen, um Ursachen schnell zu erkennen? Die Lösung In Tab. 1. haben wir in der linken Spalte 15 typische Situationen, also Veränderung eines oder mehrere...
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1. Januar 2004
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseDetektorHPLC-Tipps

Charakteristika des Brechungs-, Fluoreszenz-, und Leitfähigkeitsdetektors

Der Fall Sie arbeiten seit Jahren mit einem UV-Detektor. Sie bekommen jetzt ein neues Arbeitsgebiet und Sie brauchen nun einen weiteren Detektor, um nicht-aktive UV-Substanzen detektieren zu können bzw. um die Spezifität zu erhöhen. Geld für eine LC-MS-Kopplung ist leider nicht da, also wird ein Brechungsindex-, oder ein Fluoreszenz- oder, wenn es um die Detektion von Ionen geht, ein Leitfähigkeitsdetektor gekauft. Sie hatten bis dato nur von der Existenz dieser Detektoren gewusst. Wo unterscheiden sie sich nun von Ihrem geliebten und vertrauten UV-Detektor? Die Lösung Generell kann folgendes festgehalten werden: Alle drei sind recht „bedächtig“, sie mögen keinerlei schnelle Wechsel...
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15. November 2003
B OptimierungEluentGradientHPLC-TippsLösungsmittelOptimierungVeränderung der Retentionszeit

Säulendimensionen und Gradiententrennungen

Der Fall Wir haben uns bereits in diesem HPLC-Tipp über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der „Front“ veranlassen mich jedoch ein zweites Mal das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 x 4 mm, Fluss, 1 ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13-14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min x 20 min = 20 ml und 1,5...
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14. Oktober 2003
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungOptimierung

Muss es eigentlich immer HPLC sein?

Manche(r) fragt sich: „Was soll das für eine komische Frage und gar als HPLC-Tipp?“ Na ja, schauen wir mal. Der Fall Sie bestimmen den Gehalt eines Wirkstoffs, beispielsweise aus einer Tablette oder nach einer Freisetzung. Oder Ihre Aufgabe besteht darin zu überprüfen, ob der Kessel vor der nächsten Produktionscharge wirklich sauber ist (Reinigungsvalidierung). Wie auch immer, Sie erhalten einen einzigen Peak. Sie verwenden also eine kurze Säule, sagen wir 50 mm, das Chromatogramm dauert nicht lange, sagen wir 6 min. Wenn alles gut läuft und Sie sonst zufrieden sind, dann besteht in der Tat kein Handlungsbedarf. Sie brauchen nicht weiter...
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15. September 2003
A FehlersucheFlussHPLC-TippsVeränderung der Peakfläche

Überbefund bei Gehaltsbestimmung – eine tückische Ursache

Der Fall Sie arbeiten mit einem ganz normalen linearen Gradienten und Ihr Ziel ist die Gehaltsbestimmung von mehreren Peaks. Ihre Anlage ist qualifiziert und Sie wissen, Ihr Probengeber und Ihre Pumpe arbeiten Einwand-frei. Der Gehalt einiger Peaks ist OK, bei einigen oder bei einem finden Sie jedoch einen leichten aber reproduzierbaren und signifikanten Überbefund. Sie können durch mehrere Versuche alle, Ihnen bekannte Ursachen, ausschließen. Gibt es noch weitere „verrückte“ Ursachen für dieses Phänomen? Die Lösung Wahrscheinlich jede Menge – dafür ist HPLC bekanntlich ein Buch mit 14 Siegeln! Ich möchte Ihnen hier eine nennen: Fahren Sie einen Blindgradienten, wichtig dabei...
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10. August 2003
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsPeakverbreiterungpH-Wert des Eluentenpolare KomponentenVeränderung der Retentionszeit

Wieso ist der pH-Wert so wichtig, was bewirkt er eigentlich?

Der Fall Alle diejenigen, die mit polaren/ionischen bzw. ionisierbaren Analyten zu tun haben wissen, dass der pH-Wert des Eluenten ein sehr wichtiger Faktor ist. Was bewirkt er jetzt genau? Hinweis 1: Mit diesem Thema kann man mindestens ein Tagesseminar bzw. einen 10-seitigen Artikel problemlos füllen. Nachfolgend werden nur einige wenige, grundsätzliche Dinge angesprochen. Hinweis 2: Wir beschränken uns auf die RP-HPLC; bei der Ionenaustausch- und Ionenchromatographie herrschen klare, „geordnete“ Verhältnisse, es gibt wenige Probleme, da in der Regel nur ein Mechanismus, eben Ionenaustausch vorliegt. Die Lösung Der pH-Wert beeinflusst den Dissoziationszustand von sauren/alkalischen Komponenten sowie der freien Silanolgruppen (Rest-Silanolgruppen) an...
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7. Juli 2003
B OptimierungEluentGradientHPLC-TippsLösungsmittelOptimierungVeränderung der Retentionszeit

Säulenlänge, Fluss und Retentionszeiten bei Gradienten-Trennungen

Der Fall Hintergrund Wichtig in der HPLC sind „vernünftige“ Wechselwirkungen. So heißt es beispielsweise für isokratische Trennungen: Die interessierenden Komponenten sollten mit einem Retentionsfaktor k, von ca. 2-8 eluieren. Hier haben wir einen sinnvollen Kompromiss zwischen ausreichend starken Wechselwirkungen, robusten Bedingungen und akzeptabler Retentionszeit. Bei Gradienten-Trennungen gilt analog der mittlere Retentionsfaktor : k = mittlerer k-Wert; Analyt befindet sich in der Mitte der Säule (Längsrichtung) tG = Gradientendauer [min] F = Fluss [ml/min] Vm = Säulenvolumen Δ%B = Änderung von B während der Gradientelution S = Steigung der -Kurve; für kleine Moleküle kann für ein Wert von ca. 5 angenommen...
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14. Juni 2003
B OptimierungEluentHPLC-TippsOptimierung

Trennung von isomeren Verbindungen

Der Fall Die Trennung von isomeren Verbindungen kann sich als ein recht schwieriges Trennproblem erweisen. Das liegt u.a. daran, dass die Eigenschaften von Isomeren häufig sich stark ähneln. Welche Säulen bzw. Eluenten kämen nun in Frage? Die Lösung Vorbemerkung: Schwierige Fälle bedürfen oft unorthodoxen Lösungswegen. Diese allgemeine Maxime gilt auch hier – vor allem, wenn es um einen einmaligen, wichtigen Fall geht (Reklamation, Toxizitätsproblematik) und nicht um die Entwicklung einer Routinemethode, bei der Robustheit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im Vordergrund stehen. Also, wundern Sie sich bitte nicht ob einiger meiner Vorschläge! Säulenauswahl Hydrophobe Phasen sind hier kaum geeignet, denken Sie...
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5. Mai 2003
A FehlersucheHPLC-Tipps

Tailing in der RP-HPLC Teil 2: Weitere Ursachen und bewährte Maßnahmen

Der Fall Tailing ist eines der ärgerlichsten Dinge in der RP-HPLC. In diesem HPLC-Tipp haben wir uns mit effektiver Ursachenforschung beschäftigt. Heute wollen wir uns ein paar weitere generelle Gründe für Tailing und einige bewährte Maßnahmen zu seiner Aufhebung anschauen, siehe Tab.1 Die Lösung Abb. 1 Typische Peakformen von stärkeren Basen an einer hydrophoben, gut abgedeckten C18 Phase (links) und an nicht endcappten Phase (rechts) Abb. 2 Ein Chromatogramm aufgenommen bei verschiedenen Wellenlängen – je nach eingestellter Wellenlänge ergibt sich eine symmetrische bzw. eine „unmögliche“ Peakform. Das Fazit Nachlassende Packungsqualität und ungewollte pH-Wert-Verschiebung dürften in der Routine-RP-HPLC die wichtigsten Ursachen...
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9. April 2003
A FehlersucheHPLC-Tipps

Tailing in der RP-HPLC Teil 1: Schnelle Ursachenforschung

Der Fall Nehmen wir an, Sie erhalten bei der Injektion einer unbekannten Probe einen tailenden Peak. Die Peakform ähnelt einer der in Abb. 1 dargestellten Formen. Wie könnte man nun schnell die Ursache für das Tailing identifizieren? Abb.1 Typische tailende Peakformen in der HPLC Die Lösung Die häufigsten Ursachen für Tailing sind: Zweite Komponente an der Flanke, d.h. ungenügende Auflösung Überladung der Säule (Bemerkung: bei einer Überladung des Detektors erhalten wir meist breite, „rundliche“ aber eher symmetrische Peaks Chemisches Tailing, z. B. zusätzliche ionische/polare Wechselwirkungen zwischen einer Base und den Restsilanolgruppen der stationären Phase Die Packungsqualität hat nachgelassen, d.h. Auftreten...
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9. März 2003
B OptimierungHPLC-Tipps

Schnelle Überprüfung der Peakhomogenität, Teil 2

Der Fall Die Peaks machen am Ende einer Trennungsoptimierung einen „ordentlichen“, symmetrischen Eindruck, auch die Auflösung zwischen den Peaks ist zufriedenstellend. Wie können Sie nun mit einem vertretbaren Aufwand überprüfen, ob alle vorhandenen Komponenten tatsächlich sichtbar sind? Die Lösung Es gibt zweifelsohne eine Reihe möglicher Wege: Von einer Änderung der chromatographischen Parameter (z.B. pH-Wert, Temperatur, stationäre Phase) bis hin zu Kopplungstechniken wie LC-MS. Je nach Umfeld, Wichtigkeit der Probe etc. mag die eine oder andere Massnahme richtig bzw. gerechtfertigt sein. Nachfolgend ein Vorschlag, der sich relativ leicht realisieren lässt: Sie wiederholen die Trennung bei einer möglichst unterschiedlichen Kombination Säule –...
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9. Februar 2003
B OptimierungHPLC-Tippspolare KomponentenSäulenauswahl

Selektivität „nur“ durch unterschiedliche Wechselwirkungen?

Der Fall Wir haben alle gelernt, dass – außer vielleicht bei der Ausschluss- und der Affinitätschromatographie – eine chromatographische Trennung durch unterschiedliche Wechselwirkungen der zu trennenden Analyte mit der stationären Phase zustande kommt. Dabei werden je nach Mechanismus stark ionische bis stark hydrophobe Wechselwirkungen angenommen. Verteilungsmechanismen sind bei der HILIC ein Thema, sonst finden sie wenig Erwähnung. Sind aber lediglich Wechselwirkungen alles was die Selektivität beeinflusst? Die Lösung Nein. Auch für kleine Moleküle können sterische Aspekte von Bedeutung sein, siehe dazu Abb. 1. Bei der Trennung einer Mischung von Metaboliten von tricyclischen Antidepressiva, also durchaus kleine Moleküle, werden an zwei „polaren“...
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4. Januar 2003
B OptimierungHPLC-TippsOptimierungPeakverbreiterungpolare KomponentenSäulenauswahl

Die Sicht der Dinge… Oder: Selektivität vs. Peaksymmetrie von basischen Komponenten an hydrophoben Phasen

Nach Durchsicht meiner Notizen habe ich mich für folgendes Beispiel entschieden: Der Fall Habt ihr vor, stark basische Substanzen zu trennen? So, so, dann aber Vorsicht: Nehmt dazu von mir aus eure geliebten, modernen, teueren, sauberen, Metallionen-armen, gut abgedeckten, super endcappten Phasen. In einer Hinsicht habt ihr Recht: Ihr bekommt sicherlich schöne, symmetrische, schlanke Peaks –eine „scharfe“ Trennung eben, siehe Abb. 1. Abb.1 „Trennung“ von Pyridin/Benzylamin, Uracil (inert!), Phenol in einem sauren Phosphatpuffer an einer hydrophoben RP-Phase Seht ihr aber auch alles? Merke: Mit polaren/ionischen Komponenten und hydrophoben Phasen ist Umsicht eine unabdingbare Tugend. Die Lösung Tut mir und euch...
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5. Dezember 2002