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B OptimierungHPLC-TippsInjektionsvolumenLösungsmittelOptimierungPeakverbreiterungProbenlösungsmittelVeränderung des Chromatogramms

In wie weit beeinflusst die Probelösung die Auflösung?

Der Fall Im diesem Tipp haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probelösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit auch auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probelösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Hier möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probelösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probelösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer...
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29. Januar 2009
HPLC-TippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Der HPLC-Tipp im Dezember

Achte auf deine Gedanken, denn sie werden deine Worte. Achte auf deine Worte, denn sie werden deine Taten. Achte auf deine Taten, denn sie werden dein Charakter. Achte auf deinen Charakter, denn er wird dein Schicksal. Talmud   Liebe Leserinnen, liebe Leser, ich freue mich immer wieder sehr früh im Jahr auf den Dezember-HPLC-Tipp: Wie Sie wissen, versuche ich zum Jahresausklang Ihnen etwas besonderes anzubieten. So auch in diesem Jahr – ich hatte bereits im August etwas vorbereitet gehabt. Dennoch biete ich Ihnen statt dessen mit Erlaubnis des Autors eine Textpassage aus dem Buch von Jürgen Fuchs „Das Märchenbuch für...
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7. Dezember 2008
A FehlersucheApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseFlussHPLC-TippsPumpeVeränderung der PeakflächeVeränderung der Retentionszeit

Die Retentionszeit bleibt konstant – ist somit auch der Fluss automatisch OK?

Der Fall Sie stellen fest, dass bei Wiederholinjektionen einer Probe die Retentionszeit konstant bleibt. Bedeutet dies, dass alle Faktoren, die die Retentionszeit beeinflussen können, also – neben Temperatur, Eluent und stationärer Phase – auch der Fluss in Ordnung sind? Die Lösung Bei den drei Erstgenannten zweifelsohne, beim Fluss nicht unbedingt. Erläuterung: Bekanntlich unterscheiden wir bei einer Pumpe zwischen der Langzeit- und der Kurzzeitkonstanz. Wenn die Retentionszeit bei Wiederholinjektionen konstant bleibt, ist die Langzeitkonstanz der Pumpe (also die Streuung des Flusses im Langzeitbereich) in der Tat OK. Daneben gibt es aber auch die Kurzzeitkonstanz der Pumpe: Konstanz des Flusses im Kurzzeitbereich,...
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7. November 2008
A FehlersucheB OptimierungHPLC-TippsLösungsmittelpH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels)polare KomponentenProbenlösungsmittelVeränderung des Chromatogramms

Einfluss des Probelösungsmittels auf die Trennung

Der Fall Wir haben uns bereits über den Einfluss der Probelösung auf die Peakform und somit auf die Trennung unterhalten. So führt ein zu starkes Probelösungsmittel (Probe z. B. in mehr MeOH oder ACN im Vergleich zum Eluenten) zum Fronting oder gar zu Doppelpeaks, andererseits führt ein schwaches Probelösungsmittel – mehr Wasser im Vergleich zum Eluenten – zur Aufkonzentrierung am Säulenkopf und somit zu einer Verbesserung der Peakform. Die Folge lautet im zweiten Fall: Verbesserung der Auflösung bzw. Erniedrigung der Nachweisgrenze, vor allem bei früh eluierenden Peaks. In letzter Zeit haben wir uns intensiv mit der Injektion befasst und haben...
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7. Oktober 2008
B OptimierungC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationVeränderung des Chromatogramms

Empfehlungen in Geräte-Handbüchern – seien Sie etwas vorsichtig!

Der Fall Handbücher von Gerätehersteller sind meist sehr nützlich – zwar manchmal viel zu umfangreich und von Softwarespezialisten statt von Analytikern verfasst, aber dennoch: Manches wird erst nach deren Lektüre wirklich klar. Trotzdem ist Vorsicht geboten: Einige Empfehlungen sind irreführend oder einfach falsch. Welche Beispiele könnte man diesbezüglich anführen ? Die Lösung Dergleichen gibt es einiges, hier möchte ich beispielhaft auf zwei Empfehlungen bzgl. Einstellparameter eingehen: 1. In manch einem Manual steht, dass ein Peak mit 20-25 Datenpunkten ausreichend darstellbar sei. Dies stimmt jedoch nicht für schnelle Peaks. Bei einer Peakbreite von z. B. 9 s im Falle eines schnell...
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7. September 2008
A FehlersucheHPLC-TippsMethodentransferUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Nachfolgend möchte ich gerne diverse Themen ansprechen. Basisliniendrift ACN/TFA (Trifluoressigsäure) ist ein beliebter Gradient in der RP-HPLC. Bei niedrigen Wellenlängen hat man allerdings oft mit einer sehr störenden Drift zu tun und im Falle von kleinen Peaks wird deren Integration dadurch stark erschwert. Abhilfe: Statt der üblichen Konzentration von 0,1% TFA kann man einfach 0,085% TFA verwenden. Vielleicht wird die Selektivität kaum verändert, man stellt jedoch eine wesentlich schwächere Drift fest. Irreversible Sorption an Oberflächen Über dieses leidige Thema haben wir uns des öfteren unterhalten. Dennoch möchte ich es wieder aufgreifen, weil viele Reproduzierbarkeitsprobleme mit der Peakfläche damit zusammenhängen. Und...
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7. August 2008
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEluentHPLC-TippsLösungsmittelUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Eluent im weitesten Sinne  Mikroorganismen In MeOH/H2O/H3PO4-Gemischen können Algen recht schnell wachsen, ist dagegen ACN als organisches Lösungsmittel zugegen, passiert dies eher selten. In H2O/Essigsäure bzw. in Acetatlösungen existiert dieses Problem ebenso, denn für manche Mikroorganismen stellen Acetate, insbesondere Ammoniumacetat,  ein Leckerbissen dar. Wie auch immer, denken Sie daran, eine UV-Lampe verhindert Algenwachstum Folgender Fall: Sie haben festgestellt, dass Sie montags Vormittag häufiger Probleme mit Geisterpeaks haben als sonst die Woche über. Möglicher Grund: Natürlich läuft Ihre Milliporeanlage für das HPLC-Wasser über´s Wochenende. Weil allerdings kaum jemand am Wochenende Wasser entnimmt, kann sein, dass an der Entnahmestelle Mikroorganismen wachsen können...
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7. Juli 2008
A FehlersucheACNGradientHPLC-TippsLösungsmittel

Die „Kleinen“ im Sommer

Probleme, die direkt oder indirekt mit dem Lösungsmittel Acetonitril zu tun haben Fall 1 In einem kleinen Labor, das vom Platz her gar nicht dafür ausgelegt ist, befinden sich 6 HPLC-Geräte. Die KollegInnen dort haben immer wieder Probleme mit Retentionszeitverschiebungen und Reproduzierbarkeitsprobleme bezüglich Peakfläche. Der Grund: Die Klimaanlage schafft es einfach nicht. Im kleinen Raum ist es wegen der Wärmeentwicklung durch die Geräte recht warm. Ergebnis: Unreproduzierbare Herstellung des Eluenten, Verdampfen von Acetonitril, das als Probelösungsmittel verwendet wird und dadurch Aufkonzentrierung der Probelösung. Eine Lösung des Problems ist kurzfristig leider nicht in Sicht. Fall 2 Zwei Labors sollten eine Applikation...
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7. Juni 2008
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferUHPLC und MiniaturisierungVeränderung der PeakflächeVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Unterschiede von HPLC- und UPLC/UHPLC-Trennungen

Der Fall Seit Anfang der 2000er (Waters 2004) Jahren werden UHPLC-Geräte eingesetzt. Man könnte nun vereinfacht annehmen, es handele sich dabei um „normale“ HPLC-Geräte, die lediglich so konzipiert sind, dass sie eben hohe Drücke ermöglichen. Das Ergebnis lautet: Merkliche Reduktion der Analysenzeit und des Lösungsmittelverbrauchs, sowie – wegen der kleinen verwendeten Teilchen und der damit verbundenen hohen Bodenzahlen – Verbesserung der Auflösung. Zweifelsohne sind dies aus Anwendersicht die wichtigsten Unterschiede/Vorteile gegenüber klassischen HPLC-Trennungen. Beim Methodentransfer jedoch von HPLC- auf UHPLC-Trennungen sollte man auch an manch eine Besonderheit der UHPLC denken. Damit meine ich nicht bekannte Tatsachen wie peinliche Vermeidung von...
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7. Mai 2008
A FehlersucheAuflösungBodenzahlChromatogrammHPLC-TippsPeakverbreiterungpolare KomponentenVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Nimm Dir die Zeit und lasse Chromatogramme „sprechen“…

Der Fall Die Chromatogramme „erzählen“ viel – man sollte sich nur die Zeit nehmen, sie etwas bewusst anzuschauen. Das sei nachfolgend anhand der Chromatogramme der Abbildung 1 demonstriert. Dieses Beispiel stammt von der Arbeitsgruppe Prof. Engelhardt, Saarbrücken. Das obere Chromatogramm wurde mit einer neuen Säule aufgenommen, das zweite nachdem die Säule ein Jahr lang in Methanol/Wasser gelagert wurde. Was fällt auf und wie können wir die Unterschiede erklären? Abb. 1 Die zwei Chromatogramme wurden mit einem Abstand von ca. ein Jahr bei identischen chromatographischen Bedingungen aufgenommen, die Säule war in dieser Zeit in Methanol/Wasser gelagert Die Lösung Es fallen direkt...
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7. April 2008
A FehlersucheHPLC-TippsIntegrationMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferVariationskoeffizient (Vk)

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer

Der Fall In diesem Peak haben wir uns mit physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigt, die beim Methodentransfer zu unterschiedlichen Flächen (und somit zu unterschiedlichen Gehalten) führen  – trotz technisch einwandfreier Hardware. Hier geht es um Probleme bei der Anwendung der Methode, einmal durch unterschiedliche Zahlenwerte innerhalb der Spezifikationsanforderungen und einmal durch Unterschiede bei den Einstellparametern, sowohl was die Datenaufnahme als auch die Integration betrifft. 1. Spezifikationsanforderungen Betrachten wir als Beispiel folgende Anforderungen in einer Prüfvorschrift: „ pH-Wert des Eluenten 4,5 +/- 0,1 pH-Einheiten, Tailingfaktor des Hauptpeaks kleiner/gleich 1,3, Auflösung R zwischen Hauptpeak und Verunreinigung größer/gleich 1,5“. Im Extremfall – aber immer noch innerhalb...
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7. März 2008
A FehlersucheAuto-SamplerEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationkleine PeaksMethodentransferNachweisgrenzeProbengeberVeränderung der Peakfläche

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer

Der Fall Unterschiedliche Peakflächen – und somit unterschiedliche Gehalte – sind leider Gottes nichts Ungewöhnliches beim Methodentransfer. Wir unterstellen, dass durch Gerätequalifizierung in den betreffenden Labors technische Fehler, die zur Änderung der Peakfläche führen könnten, ausgeschlossen werden können: Fluss, Wellenlänge, Injektionsvolumen sind in Ordnung. Der Einfachheit halber gehen wir weiterhin von baugleicher HPLC-Hardware aus. Nun, es gibt für das hier besprochene Problem eine Reihe von Ursachen, an die man zunächst nicht ohne weiteres denken würde. Hier werden wir uns mit eher physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigen, in diesem Tipp geht es dann um Probleme bei der Anwendung der Methode (Auslegung von Spezifikationen...
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7. Februar 2008
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-TippsIntegrationVeränderung der Peakfläche

Auswertung über die Peakfläche oder über die Peakhöhe?

Der Fall In nahezu jedem Regelwerk wird „expressis verbis“ vermerkt, dass die Auswertung sowohl über die Peakfläche als auch über die Peakhöhe erfolgen kann. Dennoch hat sich in der Praxis bis auf wenigen Ausnahmen die Auswertung über die Peakfläche etabliert. Ich bin Realist genug zu wissen, dass sich diesbezüglich kaum etwas grundsätzliches ändern wird. Es lohnt sich allerdings schon, sich einigen Fakten bewusst zu machen. Die Lösung Zur Vorbereitung für ein Buch über Integration und Auswertung (1) haben wir uns intensiv mit dem Thema „Integration“ auseinandergesetzt. Hans-Joachim Kuss und Mike Hillebrand haben mehrere Software auf ihre Fähigkeit zur „richtigen“ Integration...
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7. Januar 2008
HPLC-TippsLebensdauer der SäuleVorsäuleZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Die Säule meldet sich zu Wort…

Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender, es weihnachtet…Lassen Sie uns auf eine etwas unkonventionelle Art und Weise ein paar Vorsichtsmaßnahmen wiederholen, die zur merklichen Verlängerung der Lebensdauer einer RP-Säule führen – die Säule meldet sich heute selbst zu Wort und bekundet auf ihre typisch unbekümmerte Art ihre Wünsche. Hallo, ich bin deine Säule! Danke, dass du mich gekauft hast; wir werden viele glückliche Wochen und Monate miteinander verbringen – aber nur, wenn du gaaanz lieb zu mir bist! Denk bitte daran, ich mag keinen Druck – übrigens genauso wie du… – aber ein Sensibelchen bin ich auch wiederum nicht: Ca. 350-380 bar...
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7. Dezember 2007
B OptimierungChromatogrammHPLC-TippsOptimierungPeaks vor - oder nahe - der Totzeitpolare KomponentenVeränderung der RetentionszeitVeränderung des ChromatogrammsVorsäule

Eine/mehrere polare Komponente(n) eluiert(en) direkt an der Totzeit – was tun?

Der Fall Nehmen wir an, Sie können Ihre viele, mehr oder weniger apolare Komponenten recht gut trennen. Nur eine oder zwei Komponente(n) bereitet(n) Ihnen Kopfzerbrechen: Jene polare eluiert(en) direkt beim Totzeitpeak bzw. an der Flanke des an der Totzeit eluierenden polaren „Drecks“. Wie auch immer, gestaltet sich deren Integration als wahres Abenteuer. Wenn Sie nun großartig Gradient, Säule usw. ändern würden, mit dem Ziel diese(n) polare(n) Peak(s) nach hinten zu verschieben, könnte es sein, dass womöglich die Trennung restlicher Peaks sich ändert/verschlechtert und dazu haben Sie logischerweise keine Lust. Was tun? Die Lösung Bauen Sie vor Ihre C18-Säule eine kurze...
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7. November 2007
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsSäule

Wie aussagekräftig ist die Angabe „X % C“ bei einer RP-Phase?

Der Fall Man findet bei den Angaben zu den physikalisch-chemischen Eigenschaften von RP-stationären Phasen in Datenblättern von Herstellern u. a. gelegentlich auch die Angabe „% C“. Man geht nun davon aus, dass je höher diese Zahl ist (also der Kohlenstoffgehalt der stationären Phase), um so stärker die Belegung und damit auch der hydrophobe Charakter der entsprechenden Phase ist. Stimmt das? Die Lösung Nicht unbedingt! Man muss auch die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Kieselgels in Betracht ziehen – hier zunächst einmal konkret dessen Packungsdichte, siehe dazu Tabelle 1, in der zwei stationäre Phasen von Waters verglichen werden. Bondapak hat zwar mit 9,80%...
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7. Oktober 2007
A FehlersucheACNChromatogrammGradientHPLC-TippsLösungsmittelVeränderung des ChromatogrammsVorsäuleWellenlänge

Ursachen für Drift

Der Fall Drift ist je nachdem zwischen lediglich störend und äußerst ärgerlich. Wann ist nun mit Drift zu rechnen? Die Lösung Nachfolgend werden die häufigsten Ursachen genannt: Isokratische Trennungen Die Temperatur ist nicht konstant. Das Problem ist allerdings nur dann wirklich groß, wenn eine merkliche Temperaturdifferenz zwischen Eluent und Säulenraum herrscht Bei einigen Detektoren wie elektrochemischem Detektor oder Brechungsindexdetektor dauert es recht lange, bis die Basislinie stabil ist Die Säule ist (noch) nicht im Gleichgewicht. Bei komplexen Eluenten (z. B. Puffer mit Ionenpaarreagenzien) oder beim Umspülen auf einen „ganz“ anderen Eluenten kann die Gleichgewichtseinstellung recht lang dauern Langsame Elution von...
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7. September 2007
A FehlersucheApparaturDetektorHPLC-Tippskleine PeaksNachweisgrenzeUncategorizedVeränderung der Peakfläche

Die „Kleinen“ im Sommer

Besteht Bedarf, das Rauschen zu minimieren (Hinweis von Hans-Joachim Kuss, München)? Man braucht dazu zunächst nur ausrechnen, wie hoch das Rauschen ist. Je nach Anforderung kann anschließend entschieden werden, ob aktuell Handlungsbedarf besteht oder eben nicht. Ein Beispiel dazu: Nehmen wir an, Sie betreiben Nebenkomponenten-Analytik, d.h. Sie haben beispielsweise einen Hauptpeak mit einem Ausschlag von 1V und mehrere kleine Peaks mit einem Reporting Level von 0,05%, was häufig das zweifache der Bestimmungsgrenze beträgt. 0,05% von 1 V – der Ausschlag des Hauptpeaks – sind 500 µV. Als Bestimmungsgrenze wird oft ein S/N-Verhältnis („Signal/Rauschen-Verhältnis“) von 10:1 definiert, im vorliegenden Beispiel sollte also...
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7. August 2007
B OptimierungFlussGradientHPLC-TippsNachweisgrenzeOptimierungUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Alternativen zu Phosphor- und Trifluoressigsäure Bekanntlich werden für den stark sauren Bereich (pH-Wert um 2-2,5) gerne H3PO4 oder TFA verwendet. Der pH-Wert wird häufig nicht eingestellt, auch auf die Verwendung von Puffern wird verzichtet: Eine mögliche kleine Verschiebung des pH-Wertes ist in diesem recht sauren Bereich nicht tragisch, eine merkliche Verschiebung der Retentionszeit wird selten beobachtet. Nun zeigt sich immer wieder, dass nicht nur der pH-Wert – sicherlich der wichtigste Faktor! – sondern auch die verwendete Säure die Selektivität beeinflussen kann. Man sollte bei Optimierungsversuchen im Sauren beispielsweise neben den üblich verwendeten Säuren Phosphor-, Trifluoressig-, Essig-, und Ameisensäure auch an...
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7. Juli 2007
A FehlersucheApparaturHPLC-TippsSpülen, Reinigen & EquilibrierenUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Kontaminierte Fritten – was bewirken sie? „Hohen Druck!“ kommt aus Ihrem Munde. Natürlich richtig, aber nicht nur. Was noch? Doppelpeaks, wobei der zweite „Peak“ bzw. Aufsetzer sich oft unterhalb der Peakmitte ansetzt, Ergebnis: oft ein tailender „Fuß“ An der verschmutzten Frittenoberfläche kann durch Adhäsionskräfte ein Teil der(s) Analyte(n) irreversibel adsorbiert werden, Ergebnis: kleinere Peakfläche Auch Luftblasen können dort leicht „hängen“ bleiben, Ergebnis: häufige(r) Luftprobleme Durch diese Blockade/Verstopfung erhöht sich lokal der Druck, damit der an der Pumpe eingestellte Fluss tatsächlich weiterhin fließen kann. Dadurch ergibt sich eine etwas höhere Temperatur, Ergebnis: geringe Abnahme der Retentionszeit Spülen mit Methanol Eine RP-Phase...
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7. Juni 2007