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A FehlersucheHPLC-TippsMethodentransferRobustheitVariationskoeffizient (Vk)

Der Gehalt hatte gestimmt, die relative Standardabweichung war in Ordnung – warum gibt es jetzt dennoch Probleme?

Der Fall In der Analytik werden zum Vergleich von Zahlenreihen oft ausschließlich der Mittelwert und die relative Standardabweichung (Variationskoeffizient, Vk) herangezogen. Entsprechen diese zwei Zahlen den Anforderungen, wird alles als bestens erachtet. Dies kann sich jedoch als Trugschluss erweisen, in der Routine kann es dennoch zu Problemen kommen. Zweifel kommen auf, ob denn diese Kriterien vielleicht doch nicht ausreichen… Das kann in der Tat so sein, schauen wir uns nachfolgend einen möglichen Grund an. Die Lösung Betrachten wir – für viele Fälle stellvertretend – drei Zahlenreihe, s. Abb. 1. Das können Werte aus Messungen an drei Geräten sein, Werte eines...
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26. März 2011
BodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-TippsOptimierung

Vom „Kult“ der Bodenzahlen… – oder was bewirkt eine hohe Bodenzahl?

Der Fall Seit einigen Jahren machen die sub 2 µm-Teilchen sowie die Fused Core (Core Shell) Materialien von sich reden. So wird gerne auf die hohen Bodenzahlen dieser Materialien hingewiesen und folglich auf die damit verbundene wesentlich bessere Trennung. Betrachten wir folgende zwei Beispiele: In der Publikation eines Herstellers steht: „Unsere Fused Core Säule X weist 264.800 Böden/m auf, die Säule Y von Firma Z mit porösen 1,8 µm-Teilchen lediglich 250.970 Böden/m“. In einer Zweiten ist die Rede von zwei Säulen, beide mit 1,7 µm-Teilchen gefüllt, die eine weist eine Bodenzahl von 318.690 Böden/m, die andere – die „schlechtere“ –...
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26. Januar 2011
HPLC-TippsZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Zwei Peaks in der Säule…

Liebe Anwenderinnen, liebe Anwender, es ist eine Weile her, dass wir von den zwei Peaks, Peaky und Chromy, etwas gehört haben. Heute jedoch sind die zwei recht ungleichen Freunde wieder beisammen: Zum Einen der kleine Peaky Säure aus Polarweiler, wie eh und je quirlig, ungeduldig, frech und mit einem für ihn typisch losen Mundwerk, welches man ihm leider nicht mehr abgewöhnen kann. Und zum Anderen Chromy von Kieselhausen aus Hydrophobingen, groß, ruhig, höflich, ein Herr von Format, ein Gentleman der alten Schule. Beide sitzen nun seit kurzem auf zwei unterschiedlichen Borsten-Stühlen im „Cafe de bifunktionale Colona“ – jenem berühmten langgestreckten...
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26. Dezember 2010
A FehlersucheApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseGradientHPLC-TippsMethodentransferVeränderung des ChromatogrammsVerweilvolumen

Sind ein kleines „Delay Volume“ der Apparatur und/oder ein kleines Volumen der Mischkammer immer „gut“? oder: Was ein Paar „Mikroliterchen“ alles bewirken können…

Der Fall Im Zuge der Verbreitung von UHPLC-Geräten warten die Hersteller mit immer kleineren Verweilvolumina (Verweilvolumen, auch: Verzögerungsvolumen, „Delay Volume“, „Dwell Volume“, das ist das Volumen von der Mischkammer bis zur Säule) bzw. Volumina der Mischkammer (35 – ca. 60 µl) auf. Da ist zunächst nichts dagegen einzuwenden. Kleine Volumina können jedoch auch Nachteile mit sich bringen. Dabei denke ich im Moment nicht an eine erhöhte Gefahr für Niederschläge im Falle von starken Puffern. Und auch nicht an eine schlechte Mischungsqualität imfalle von großen Unterschieden in der Viskosität der zu mischenden Lösungsmittel in Kombination mit einem kleinen Volumen der Mischkammer....
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26. November 2010
A FehlersucheChromatogrammFlussHPLC-TippsMethodentransferVeränderung der PeakflächeVeränderung des Chromatogramms

Unterschiede in den HPLC-Anlagen – die Peakfläche

Der Fall Dass Geräte von unterschiedlichen Herstellern große Unterschiede aufweisen können, ist eine HPLC-Binsenweisheit. Der Unterschied kann im Verweilvolumen bei Gradientenanlagen liegen (Hochdruck vs. Niederdruck), in der Richtigkeit bei der Wellenlängeneinstellung (z. B. +/- 2 nm vs. +/- 4 nm), im Material der Nadel im Probengeber (z. B. Stahl vs. Keramik) und damit verbunden evtl. Memoryeffekte, in der unterschiedlichen Geometrie der Mischkammer oder der Detektorzelle bei u. U. identischem Volumen und, und…Diese Unterschiede sowie die Folgen sind erfahrenen AnwenderInnen bekannt: Unterschiede in der Retentionszeit, in der Peakfläche und in der Peakform. Im hiesigen Peak möchte ich gerne auf zwei Sachen...
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26. Oktober 2010
A FehlersucheEinstellparameterHPLC-TippsIntegrationVariationskoeffizient (Vk)

Einstellparameter und Variationskoeffizient

Der Fall Einstellparameter wie Zeitkonstante („time constant“), Peakwidth, Datenrateaufnahme („sample rate“), Bandwidth etc. können die Integration und somit Peakfläche und Befund stark beeinflussen. Wir haben uns bereits darüber unterhalten, Details finden sich in (1), (2) und (3). In wie weit beeinflussen nun diese Parameter auch die Streuung der Werte im Falle von Wiederholmessungen? Die Lösung Nachdem ich in der Literatur diesbezüglich nicht fündig geworden bin, wurde in einer kleinen Studie an einer UPLC-Anlage der Einfluss diverser Einstellparameter auf den Vk systematisch untersucht. Dazu wurde zunächst mithilfe von Systemeignungstests die Zuverlässigkeit der Anlage überprüft. Anschließend wurden aus einem vial je 10...
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27. September 2010
A FehlersucheEluentGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsLC-MS-KopplungLösungsmittelUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Der Eluent ist eine schier unendliche Geschichte… 1. Von „Gebirgen“ in der Basislinie und Läufe im Sommer und im Winter imfalle von ACN/Wasser-Eluenten Der Fall Sagen wir, Ihnen ist aufgefallen, dass Sie im Sommer mit ACN/Wasser- bzw. Puffer-Gemischen mehr Probleme haben als im Winter: Basislinieschwankungen, evtl. zusätzliche, breite Peaks etc. Mögliche Erklärung: Eine frisch hergestellte Mischung beispielsweise von 85/15 ACN/Wasser- bzw. Puffer ist bekanntlich kalt und wir haben zunächst auch keine Probleme. Es kann nun passieren, dass im Sommer trotz Klima-Anlage die Temperatur im Labor 27-29 °C beträgt. Die höhere Temperatur begünstigt die Bildung von Polymeren – ein bekanntes Problem...
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27. Juli 2010
A FehlersucheEluentHPLC-TippsLösungsmittelUncategorized

Die „Kleinen“ im Sommer

Tipps rund um den Eluenten Es hat sich gezeigt, dass imfalle von ternären Mischungen bei bestimmten Mischverhältnissen die Dichtungen „streiken“, z. B: Eine Mischung 25/25/50 MeOH/ACN/Wasser führt zu Leckagen, nach dem Wechsel jedoch zu einer Mischung 10/40/50 MeOH/ACN/Wasser ist wieder alles in Lot Die Peakform von basischen Analyten lässt manchmal auch bei Verwendung von modernen stationären Phasen zu wünschen übrig. Durch eine Erhöhung der Ionenkonzentration im Eluenten wird die Peaksymmetrie besser, man möchte allerdings nicht unbedingt die Pufferstärke verändern, was ja auch Erhöhung der Ionenkonzentration bedeuten würde. Man könnte nun folgendes tun: Zum Wasser (oder zum Puffer) werden ca. 2...
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27. Juni 2010
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLebensdauer der SäuleRobustheit

Überprüfung der Säulenstabilität in der RP-HPLC

Der Fall In der Routine werden AnwenderInnen immer wieder mit folgender Situation konfrontiert: Die Lebensdauer manch´ einer Säule lässt zu wünschen übrig. Und dies obwohl die Methode validiert und die Robustheit überprüft worden ist. Der Grund liegt oft darin, dass bei der Überprüfung der Robustheit einer Methode zwar Methodenparameter wie pH-Wert, Eluentenzusammensetzung, Säulencharge, Temperatur etc. im Focus stehen, die Säulenstabilität jedoch nicht als prüfenswert erachtet wird. Das Ergebnis: Eine wunderbar selektive Säule erweist sich ob ihrer geringen Lebensdauer für einen Routineeinsatz einfach als ungeeignet. Wie kann nun die Säulenstabilität geprüft werden? Die Lösung Man bedient sich eines 3-Stufen Plans: 1....
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27. Mai 2010
A FehlersucheGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsProbe

Das kann mit der Probe in der Säule passieren

Der Fall Kieselgel ist ein sehr guter Feststoffkatalysator, er wird vielfach in der chemischen Industrie eingesetzt. In der RP-Chromatographie nun, wo ja Kieselgel die mit Abstand wichtigste Matrix darstellt, führt seine Umsetzung mit Silanen aufgrund von sterischen Effekten zu einem Umsetzungsgrad von lediglich ca. 50-70%. Das bedeutet, dass RP-stationäre Phasen eine „nackte“ Kieselgeloberfläche von immerhin ca. 30-50% aufweisen können. Die katalytische Wirkung von Kieselgel kann dazu führen, dass manch eine Substanz in der Säule chemisch verändert wird. Das Ergebnis: Peaks, die im Chromatogramm erscheinen, könnten Substanzen sein, die in der Säule durch die katalytische Wirkung des Kieselgels entstanden sind und...
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27. April 2010
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tippspolare KomponentenStationäre Phase

HILIC und Co… oder: HILIC ist nicht gleich HILIC!

Der Fall Die Trennung von stark polaren Komponenten mittels HPLC stellt oft eine echte Herausforderung dar. Nachfolgend stichwortartig einige Möglichkeiten: RP-Modus Wasseranteil sowie Salzkonzentration im Eluenten erhöhen (z. B. bis 90%, bei bestimmten stationären Phasen bis 95-100% Wasser/Puffer möglich). Dadurch wird der Eluent sehr polar und die Analyte – die ja stets eine erhöhte Hydrophobie im Vergleich zum polaren Eluenten aufweisen – werden zu hydrophoben Wechselwirkungen mit der stationären Phase „gezwungen“. PH-Wert verändern bzw. – wenn es denn unbedingt sein muss… – Ionenpaarreagenzien verwenden. Dadurch wird eine saure/basische Komponente neutralisiert bzw. maskiert, auch hier ist das Ergebnis die Verstärkung von neutralen/hydrophoben...
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29. März 2010
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Effektives Spülen einer RP-HPLC-Säule

Der Fall Dass eine HPLC-Säule ab und zu gespült werden muss, ist eine Binsenweisheit. Nur, wie macht man so etwas effektiv – es soll gründlich und es soll auch ökonomisch sein. Wenn Sie im Labor eine entsprechende Spülprozedur haben mit der Sie zufrieden sind, besteht natürlich kein Handlungsbedarf. Und Sie sind wahrscheinlich zufrieden, wenn Sie erstens bei Ihren Läufen keine Geisterpeaks, keinen Memoryeffekt, keine „Buckel“ etc. feststellen und zweitens die ganze „Spülerei“ keine 2-3 Stunden in Anspruch nimmt. Sollte allerdings einer dieser zwei Fakten zutreffen, bestünde womöglich Optimierungspotenzial. Nachfolgend finden Sie einen Vorschlag. Die Lösung 1. Verunreinigungen Vorbemerkung als Erinnerung...
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21. Februar 2010
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammGradientHPLC-TippsIntegration

Integration von Peaks auf einer driftenden Basislinie

Der Fall Bei Gradiententrennungen oder im Falle von Matrix-belasteten Proben müssen oft Peaks, die sich auf einer mehr oder weniger stark driftenden Basislinie oder auf einem flachen „Buckel“ befinden, integriert werden. Die Frage ist nun, wie tut man so etwas am besten? Da die meisten Anwender nicht über Peakhöhen auswerten, wird hier auf diese – oft sinnvolle – Möglichkeit nicht weiter eingegangen. Die Lösung Nachfolgend werden für zwei Fälle Lösungsansätze vorgeschlagen, die sich nach aufwendigen Überprüfungen als das kleinere Übel erwiesen haben (1). 1. Nicht-aufgelöste Peaks auf einer abfallenden Basislinie, s. Abb. 1. (Das Beispiel wurde freundlicherweise von Hans-Joachim Kuss...
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29. Januar 2010
HPLC-Tippspolare KomponentenZ - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Der HPLC-Tipp im Dezember

Liebe Leserinnen, liebe Leser, wir haben es geschafft und einige von uns sind womöglich auch selbst geschafft: Ein nicht ganz gewöhnliches Jahr neigt dem Ende zu. Zeit, sich etwas Zeit zu nehmen und vielleicht das eine oder andere zu reflektieren. Vergessen Sie für einen Moment die rein fachlichen Dinge und begleiten wir gemeinsam den kleinen POL Ari auf einer seiner Abenteuerreisen. Von kalten, dunklen Seen und von knisternden Begegnungen… POL Ari schaute sich um: Es war still und recht kalt in der Tiefe des dunklen Sees. Das bläuliche, gedämpfte Licht verstärkte die unheimliche Stimmung. Dies störte ihn allerdings herzlich wenig,...
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29. November 2009
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungUHPLC und Miniaturisierung

Wenn „UHPLC“ als UHPLC genutzt werden soll…

Der Fall Seit Einführung der UPLC von Waters im Jahre 2004 haben mehrere Anbieter nachgezogen, in der Zwischenzeit wird eine ganze Reihe von UHPLC-Systemen angeboten. Diese Geräte machen den Großteil der Neukäufe aus. Die Erfahrungen sind durchaus positiv, man sollte sich jedoch einige Sachen bewusst machen. Die Lösung Manchmal werden UHPLC-Geräte lediglich zur Verkürzung der Analysenzeit von alten Methoden benutzt. Beispielsweise wird aus einem alten 20-30 min-Lauf mit 5-10 Peaks mithilfe der UHPLC ein 5-8 min-Lauf. Wenn dies in etwa das avisierte Ziel war und man damit zufrieden ist, ist alles OK, der Methodentransfer HPLC-UHPLC sollte funktionieren und im Alltag...
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29. Oktober 2009
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEluentHPLC-TippsLösungsmittelWasser

ACN-Knappheit – wie hatte damals der Markt darauf reagiert?

Der Fall Vor Längerem schockierte eine plötzlich aufgetretene ACN-Knappheit den Markt. Hier aber auch in Broschüren und auf den Webseiten nahezu aller großen Anbieter wurden damals diverse Vorschläge zur (M)Linderung des Problems diskutiert. Die Brisanz des Problems ist heute Geschichte, die hohen Preise dagegen sind geblieben. Ein derartiges Scenario kann sich jedoch wiederholen. Wie auch immer, ist in das Bewusstsein der Anwender durch diese Situation folgendes Ziel wesentlich stärker gerückt: Der Lösungsmittelverbrauch soll möglichst reduziert werden – das gebietet neben ökonomischen Gründen auch unsere Verantwortung gegenüber der Natur – man bräuchte also brauchbare Alternativen zu ACN. Mich hat nun die...
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29. September 2009
A FehlersucheACNChromatogrammEluentHPLC-TippsIntegrationUncategorizedVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Die „Kleinen“ im Sommer

Verschiebung der Retentionszeit (2) Im diesem Tipp haben wir uns mit der Verschiebung der Retentionszeit beschäftigt, die Ursachen lagen in einer Veränderung der stationären Phase im Sinne der „Chemie“. Hier werden wir uns Änderungen der mobilen Phase widmen. Auch in diesem HPLC-Tipp geht es um ungewollte Veränderungen, also um solche, die nicht vom Anwender bewusst vorgenommen wurden, z. B. Eluenten-Zusammensetzung oder pH-Wert verändert. Nachfolgend werden einige Gründe für eine veränderte Eluenten-Zusammensetzung genannt. Sie resultieren durch kleine, ungeachtete/unbedachte Variationen beim Ansetzen der mobilen Phase oder während der Trennung. Ein Eluent wird z. B. manchmal dadurch hergestellt, dass der Puffer und die...
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29. Juli 2009
A FehlersucheChromatogrammHPLC-TippsUncategorizedVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Die „kleinen“ im Sommer

Hier geht es um eine unerwartete Verschiebung der Retentionszeit, d.h. um eine, die ohne eine bewusste Veränderung seitens des Anwenders erfolgt ist, also: Es wurde keine längere/kürzere/dünnere Säule eingebaut oder die Flussrate geändert. Grundsätzlich liegt in einem solchen Fall eine Verschiebung der Retentionszeit an einer Änderung der Temperatur, der stationären Phase (d.h. „Chemie“ der Oberfläche) und des Eluenten. Ungewollte Temperaturänderung stellt ein eher seltenes Problem dar, deswegen werden wir uns hier zunächst mit der stationären und dann dort mit der mobilen Phase befassen. Veränderung der stationären Phase Bemerkung: Es geht hier um eine Veränderung im Sinne der „Chemie“, d.h. nicht...
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29. Juni 2009
ApparaturAuflösungBodenzahlC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-TippsInjektionsvolumenPeakverbreiterungTotvolumen

„Trennleistung“, „Effizienz“, „Bandenverbreiterung“ das alles bedeutet doch fast das gleiche – oder?

Der Fall Betrachten wir folgende drei Säulen: 250 mm 5 µm, 150 mm 3 µm und 75 mm 1,5 µm. Mit Hilfe der empirischen Formel: Bodenzahl = 3.000 x Länge der Säule in cm durch Teilchengröße in µm stellen wir leicht fest, dass alle drei Säulen – vorausgesetzt sie sind gleich gut gepackt – die gleiche Bodenzahl, nämlich 3.000 x 5 = 15.000 Böden liefern. Sind nun die Säulen wirklich vergleichbar, kann ich also bei gleicher Bodenzahl (15.000 Böden) und völlig identischen chromatographischen und apparativen Bedingungen die gleiche Trennung, sprich die gleiche Auflösung erwarten? Bemerkung: Vorteile der kürzeren Säulen wie...
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29. Mai 2009
AuflösungB OptimierungBodenzahlHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungNachweisgrenzeOptimierungVeränderung der Retentionszeit

Wie kann die Bodenzahl erhöht werden?

Der Fall Halten wir zunächst folgendes fest: Eine Erhöhung der Selektivität stellt mit Abstand die effektivste Maßnahme dar, um die Auflösung zu verbessern. Folglich sollte diesem Schritt als erstem die ganze Aufmerksamkeit zu Beginn einer Methodenoptimierung geschenkt werden. Wenn jedoch eine Verbesserung der Selektivität mit einem vertretbaren Aufwand nicht zu erzielen ist, wäre die Erhöhung der Bodenzahl der zweitbeste Weg. Welche Möglichkeiten gibt es nun, dies zu erreichen und welche Maßnahme „bringt“ wie viel? Die Lösung In Abb. 1 sind die Möglichkeiten zusammengefasst, die zu einer Erhöhung der Bodenzahl führen. Symbol-Erklärung: N: Bodenzahl R: Auflösung („Resolution“) S/N: Peak/Rausch-Verhältnis („Signal to...
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29. April 2009