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A FehlersucheGeisterpeaks & negative PeaksHPLC-Tipps

Wie vermeide ich Memory-Effekte?

Der Fall Unerwartete Peaks im Chromatogramm können mehrere Ursachen haben. Luftblasen, Verunreinigungen, spät eluierende Substanzen und eben Memory-Effekte. Wie wird der Memory-Effekt als solcher erkannt und wie kann dieser dann eliminiert werden? Die Lösung Vom Memory-Effekt sprechen wir, wenn eine Substanz irgendwo im System irreversibel adsorbiert wird und später durch teilweise Desorption als Peak oder „Buckel“ im Chromatogramm erscheint. Die Gründe für diese Teil-Desorption der Substanz können Flusserhöhung, Druckstoß, Lösungsmittelwechsel oder plötzliche Änderung der Elutionskraft z. B. beim Stufengradienten sein. Oder aber, die Kapazität einer pseudostationären Phase ist erschöpft. Es kann auch sein, dass ein Memory-Effekt die ganze Zeit vorhanden...
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sk
9. Februar 1994
A FehlersucheHPLC-Tipps

Chemisches Tailing bei Anwesenheit von Metallionen

Der Fall Das chemische Tailing ist ein häufiges Problem bei der Trennung von polaren (genauer: ionischen) Substanzen in der HPLC. Als Ursachen werden freie Silanolgruppen an der Oberfläche des Kieselgels angesehen. Heute wissen wir, dass Metallionen in der stationären Phase einen noch größeren Einfluss auf die Trennung haben. Diese Metallionen können aus diversen Quellen, wie der Herstellung des Kieselgels, aus dem verwendeten Puffer, den Stahl- aber auch Titankapillaren usw. stammen. Ohne hier tiefer auf die Problematik eingehen zu wollen, halten wir folgendes fest: Chemisches Tailing bedeutet gehemmte Kinetik. Eine mögliche Ursache ist in der Tat die Existenz von Metallionen, die...
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sk
8. Januar 1994
A FehlersucheEluentHPLC-TippsVeränderung der RetentionszeitVeränderung des ChromatogrammsWasser

Warum funktioniert mein ,,Normal-Phase“-System nicht mehr?

Der Fall Sie arbeiten mit einem ,,Normal-Phase“-System, z. B. SiO2 als Säule und Heptan als Eluent, es funktioniert alles wunderbar. Sie setzen nun einen frisch hergestellten Eluenten ein und … am liebsten würden Sie gleich nach Hause gehen, die Retentionszeiten sind völlig aus dem Häuschen. Wieso dies auf einmal, obwohl sonst alles im System erwiesenermaßen in Ordnung ist? Die Lösung Die mangelnde Reproduzierbarkeit in der Kieselgelchromatographie (Adsorptionschromatographie, ,,Normal-Phase“) ist, neben des limitierten Lösevermögens von organischen Lösungsmitteln für polare Substanzen, das Problem Nr. 1 dieser Systeme. Fast immer liegt der Grund im (unkontrollierten) Wassergehalt des Gesamtsystems: HPLC-Apparatur, Probe, Eluent, Säule. Wasser,...
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sk
7. Dezember 1993
A FehlersucheBodenzahlHPLC-TippsLebensdauer der SäulePeakverbreiterungpH-Wert des Eluenten

Ich habe einen großen Verschleiß an RP-Säulen, was ist zu tun?

Der Fall Nehmen wir folgende Situation: Ihnen ist aufgefallen, dass Sie, im Vergleich zu früher, einen größeren Verschleiß an RP-Säulen haben. Ihre Säulen sind einfach schneller kaputt. Ihr Säulenlieferant ist zwar nicht sonderlich traurig darüber, doch die Ursache interessiert Sie nun doch. Was heißt eigentlich ,,kaputt“? Wenn wir vom erhöhten Rückdruck absehen, zeigt sich eine Qualitätsminderung in einer Abnahme der Bodenzahl (breite Peaks, die Packung ist nicht mehr in Ordnung) oder/und in einer Änderung der Retentionszeit (chemische Veränderung der Oberfläche der stationären Phase). Welche Gründe könnten dafür verantwortlich sein? Die Lösung Leider gibt es mehrere mögliche Gründe. Nachfolgend finden Sie...
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6. November 1993
A FehlersucheEluentFlussHPLC-TippspH-Wert des EluentenStationäre PhaseVeränderung der Retentionszeit

Was sind die Gründe für eine Verschiebung der Retentionszeit?

Der Fall Eine unbeabsichtigte Änderung der Retentionszeit ist eine ärgerliche Angelegenheit. Die möglichen Ursachen sind für alle Mechanismen in der HPLC prinzipiell die glei­chen. Eine Retentionszeitverschiebung bedeutet immer eine Änderung (mindestens) einer dieser Pa­rameter: Δ stationäre Phase Δ Eluent Δ Temperatur Δ Fluss Auch die Vorgehensweise zur Eingrenzung und Eliminierung des Problems ist für alle Trennmechanismen im Prinzip die gleiche. Hier möchten wir uns jedoch auf den verbreitetsten Modus, die RP-Chromatographie, konzentrieren. Eine Systematik in der Ursachenforschung kann eine beträchtliche Zeitersparnis bedeuten. Die Lösung Wir unterscheiden drei Fälle: Sie setzen die C18-Säule eines anderen Lieferanten oder eine Säule aus einer...
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sk
5. Oktober 1993
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-Tipps

Eine interessante Alternative zu der Trennung von Säuren und Basen mittels Puffer

Der Fall Im Sauren liegen schwache Säuren undissoziiert vor. In der undissoziierten Form ist eine Wechselwirkung mit einer C18-Phase möglich, die Retentionszeit ist groß. Basen dagegen liegen protoniert vor, in ionischer Form wissen sie nichts mit einer hydropho­ben Oberfläche anzufangen, sie eluieren früh. Im Alkalischen ist es umgekehrt: Basen liegen undissoziiert, die Säuren in ionischer Form vor. Diese Verhältnisse sind der Grund dafür, daß man die Selektivität bei der Trennung von Säuren und Basen gezielt mit dem pH-Wert verändern kann. So weit, so gut. Geht es auch ohne Puffer? Die Lösung Abb. 1 zeigt die Abhängigkeit der Retentionszeit vom Methanolgehalt...
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4. September 1993
A FehlersucheHPLC-TippspH-Wert des Eluenten

Für welchen pH-Wert eignet sich welcher Puffer?

Der Fall In einem Labor sollte die HPLC-Trennung von neutralen und ionischen Komponen­ten in einem Lauf zu einer Routineaufgabe werden. Die erzielte Selektivität war zu Beginn ausreichend (Selektivitätsfaktor α = 1,2). Jedoch beklagten sich die Anwen­der immer wieder über Probleme mit unreproduzierbaren Retentionszeiten, obwohl die Säule genügend equilibriert war. Das chromatographische System bestand aus ei­nem Isokraten mit UV-Detektor und einer handelsüblichen C18-Säule. Die mobile Phase setzte sich aus 40 % Methanol und 60 % 40 mM Phosphatpuffer (w/w) zusam­men bei einem pH-Wert von 4,5. Was war das Problem? Die Lösung Die AnwenderInnen haben hier einen weniger geeigneten Puffer gewählt, der pH-Wert...
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3. August 1993
A FehlersucheFlussHPLC-Tipps

Die Retentionszeiten sind länger geworden – ist es die Pumpe oder der Eluent?

Der Fall Man kennt diesen ärgerlichen Fall, der öfter auftritt, als einem lieb ist: Die Retenti­onszeiten verschieben sich unbeabsichtigt – meistens nach hinten. Die Gründe hierfür können vielfältig sein, z. B: Luft in der Pumpe Schmutz an den Einlass- oder Auslassventilen Leckage => diese Ursachen erzeugen einen geringeren Fluss Abnahme der Säulentemperatur Änderung der stationären und/oder Änderung der mobilen Phase Um schnell zu einer Lösung zu kommen, müssen wir uns fragen, ob man nun mit einem Blick auf die zwei erhaltenen Chromatogramme eine oder mehrere der oben erwähnten Ursachen ausschließen kann, siehe Abb. 1? Abb. 1: links: „Normales“ Chromatogramm; rechts:...
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2. Juli 1993
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tipps

Basislinienrauschen und seine Dämpfung

Der Fall Ihre Pumpe pulsiert extrem stark. Trotz neuer Ventile und Dichtungen, gründlicher Reinigung mit Isopropanol, besser entgasten Eluenten, Erneuerung des Druckaufnehmers – mehr kann man wirklich nicht tun! – ist keine merkliche Besserung in Sicht. Sie wollen sich noch nicht von ihr trennen. Aber Sie kämpfen in der Spuren­analytik und brauchen ein ordentliches Peak/Rauschen-Verhältnis oder/und Sie arbeiten mit einem pulsationsempfindlichen Detektor, wie z. B. Brechungsindex-, Fluores­zenz- oder elektrochemischen Detektor. Was tun? Die Lösung Ganz einfach: Sie bauen nach der Pumpe einen guten Pulsationsdämpfer ein. Das ist zwar bei Gott nichts Neues, doch habe ich das Gefühl, dass viele Anwender...
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1. Juni 1993
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEluentHPLC-TippsLösungsmittelOptimierung

Methanol vs. Acetonitril II

Der Fall Methanol und Acetonitril sind zweifelsohne die wichtigsten organischen Lösungsmittel in der RP-Chromatographie. Wir haben uns bereits im Tipp „Methanol vs. Acetonitril I“ über Vor- und Nachteile der zwei Lösungsmittel unterhalten. Hier noch einmal kurz jeweils einige wichtige Vorteile: Acetonitril hat eine geringere Viskosität; das führt zu einem kleineren Druckabfall und in der Regel zu einer besseren Peakform, die Lebensdauer der Säule ist größer. Weiterhin ist es wegen der geringeren UV-Absorption im unteren Wellenlängenbereich vorteilhafter. Methanol ist billiger und vermeintlich weniger gesundheitsschädlich. Ferner besteht mit Methanol – da es polarer ist – eine geringere Gefahr, dass bei Verwendung von...
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15. Mai 1993
ApparaturAuflösungB OptimierungBodenzahlHPLC-TippsPeakverbreiterungTotvolumen

Gebunden an einer Prüfvorschrift – wie kann man dennoch eine schlechte Trennung verbessern?

Der Fall Sie arbeiten, sagen wir, in der Qualitätskontrolle und sind an strenge Prüfvorschriften gebunden. In einer solchen lautet die Forderung: „Auflösung R größer 1,5“, aber gerade diesen Wert erreichen Sie aktuell nicht. Welchen legalen Tricks können Sie sich bedienen? Die Lösung Was möglich ist, hängt letzten Endes davon ab, wie genau die Angaben in der betreffenden PV sind. Ist in der Tat restlos alles, von der Eluentenzusammensetzung bis zu den PC-Einstellungen („Settings“), vorgegeben, können Sie es nur mit einer neuen Säule versuchen. Ist die PV etwas „weicher“, d.h. es sind nur die wichtigsten Parameter wie Säule, Eluent, Temperatur, Fluss,...
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9. April 1993
B OptimierungGradientHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungOptimierung

Entwicklung einer RP-Trennung – die „2 –Tage-Methode“ Teil 2: Feinoptimierung

Der Fall Sie haben nun, wie in diesem Tipp geschildert, die „optimale“ Säule ausgesucht, jetzt haben Sie knapp einen Tag Zeit für die Feinoptimierung. Wie geht´s weiter? Die Lösung Nehmen wir an, Sie haben viele Peaks, also werden Sie wahrscheinlich mit dem Gradienten weiter experimentieren. 1. Ziel: „Vernünftige“ Analysendauer + grob „gute“ Trennung Die Möglichkeiten: Gradientenvolumen erhöhen/erniedrigen – am besten über den Fluss, siehe z. B. diesen Tipp Anfangs- und Endbedingungen variieren Evtl. Steilheit, Gradientenprofil ändern beziehungsweise eine isokratische Stufe einbauen. Zeitbedarf: ca. 2 Stunden 2. Ziel: Selektivität verbessern Die Möglichkeiten: pH-Wert um +/- 0,5 pH-Einheiten variieren Modifier wie z.B....
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9. März 1993
ACNB OptimierungEluentHPLC-TippsOptimierungpH-Wert des Eluentenpolare KomponentenRobustheitVeränderung der RetentionszeitVeränderung des Chromatogramms

Nachteile beim Einsatz von Puffern

Der Fall Puffer sind unerlässlich bei Routinetrennungen von polaren/ionischen Komponenten. Gibt es auch Nachteile bei deren Einsatz? Die Lösung Ja, folgende: Die Eigen-UV-Absorption des Eluenten nimmt zu, das Ergebnis lautet: Erhöhung der Nachweisgrenze, evtl. unruhigere Basislinie Die Lebensdauer der Säule nimmt ab, denn durch Erhöhung der Konzentration an Ionen im Eluenten wird letzterer polarer und der polarer gewordene Eluent kann das polare Kieselgel auflösen – nach dem Prinzip: Ähnliches löst ähnliches auf Sehr wichtig: Durch den Einsatz von Puffern haben wir eine Art Gleichmacherei, was die Selektivität von stationären RP-Phasen betrifft. Erläuterung: Ein Puffer wird verwendet, um einen bestimmten pH-Wert...
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7. Februar 1993
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsSäuleSäulenauswahl

Selektivitätsregeln für die Auswahl von RP-Säulen

Der Fall Der Trennmechanismus, der für die Selektivität in der RP-Chromatographie verantwortlich ist, kann bekanntlich eine recht diffizile Angelegenheit sein. Können dennoch gewisse Gesetzmäßigkeiten beobachtet werden? Ja, einige davon wollen wir uns jetzt anschauen. Die Lösung Aus einer Vielzahl von Experimenten mit recht unterschiedlichen Substanzen und Eluenten kann wie folgt bezüglich Eignung von polaren/apolaren RP-Phasen festgehalten werden: Eignung polarer Phasen: Ungepufferte Eluenten – Hydrophobe, unsubstituierte „große“ Aromaten – Planare/nicht-planare Aromaten – Isomere (Stellungs-, Doppelbindungsisomere) Gepufferte Eluenten – Basische Substanzen; die gute Selektivität rückt jedoch durch die häufig schlechte Peakform in den Hintergrund – Mittelstarke (dissoziiert vorliegende) Säuren – Stark polare...
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5. Januar 1993
ApparaturB OptimierungBodenzahlChromatogrammHPLC-TippsOptimierungPeakverbreiterungTotvolumenVeränderung der PeakflächeVeränderung des Chromatogramms

Beitrag der einzelnen Module einer Anlage zur Bandenverbreiterung

Der Fall Häufig ist unser chromatographisches System selektiv. Wir haben allerdings stets gegen die Peakverbreiterung anzukämpfen. Wo können wir hier sinnvollerweise ansetzen? Vorbemerkung: Eine apparativ bedingte Bandenverbreiterung spielt bei Gradiententrennungen in der Regel kaum eine Rolle (wir sprechen nicht von Hunderten, sehr ähnlichen Komponenten…). Die Lösung Um diese Frage zu beantworten können wir folgenden Ansatz anwenden: In der Chromatographie – wie überhaupt in der Analytik – herrschen fast immer stochastisch unabhängige Prozesse. Das sind Prozesse, bei denen die Streuung eines Messwertes in den einzelnen Schritten des Prozesses (z. B. in den einzelnen Modulen einer Apparatur) unabhängig von der Streuung in den...
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14. Dezember 1992