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ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungMethodentransferVeränderung des ChromatogrammsVerweilvolumen

Übernahme einer Gradientenmethode – der Einfluss der Appa­ratur

Der Fall Ein klassischer Fall: Sie übernehmen eine Gradientenmethode und, obwohl Sie pein­lichst auf Einhaltung aller chromatographischen Bedingungen achten, erhalten Sie mit Ihrer Anlage ein anderes Chromatogramm. Warum? Die Lösung Fast immer liegt der Grund in den unterschiedlichen Verweilvolumina (Verzögerungs­volumina, Delay Volume oder Dwell Volume) einmal Ihrer Anlage und zum anderen der Anlage, mit der die Methode entwickelt wurde. Als Verweilvolumen wird das Volumen vom Ort der Mischung der zwei Eluenten (Mischventil, Mischkammer, T-Stück) bis zur Säule be­zeichnet. Dieses kann je nach Hersteller von ein paar hundert Mikrolitern bis zu mehreren ml betragen! Die Hochdruckgradienten haben im Vergleich zu den...
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sk
22. Oktober 1995
ApparaturC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsMethodentransferPeakverbreiterungTotvolumen

Was sagt mir das Totvolumen einer isokratischen Anlage?

Der Fall Sicherlich haben Sie vom Totvolumen („extra column volume“) einer HPLC-Anlage gehört. Wenn Sie zu den AnwenderInnen gehören, die dieses gemessen und es ,,im Griff“ haben, brauchen Sie nicht weiter zu lesen, gehen Sie einfach zu einem nächsten HPLC-Tipp. Dieser HPLC-Tipp wendet sich an Leser, die der Meinung sind, dass nur TheoretikerInnen und ,,Supergenaue“ sich dafür interessieren sollten. Sie selbst möchten nur eine gute Trennung und haben für solche Spielchen keine Zeit. Ich stimme mit Ihnen völlig überein. Das was zählt, ist in der Tat die Trennung. Doch das Totvolumen beeinflusst sie, bei früh eluierenden Peaks und im isokratischen...
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21. September 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLebensdauer der Säule

Wie stark sollte der Puffer sein?

Der Fall Puffer sind bei der Trennung von ionischen Substanzen wichtig: Oft ist erst durch einen bestimmten, konstant zu haltenden pH-Wert (deswegen der Puffer) die gewünschte Selektivität und Reproduzierbarkeit zu erreichen. So weit, so gut. Mal übernimmt man nun eine Methode, in der der Eluent 5 mMol stark ist, bei der nächsten Methode ist die Rede von 100- oder sogar 150-mMol-Lösungen, und manchmal weiß man es einfach nicht, wie bei folgendem Beispiel: ,,Man wiege so viel mg von Salz X und gebe so viel ml an Säure Y oder Base Z zu!“ Wie kritisch ist die Pufferstärke jetzt wirklich und...
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21. August 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsLebensdauer der Säule

Der pH-Wert meines Eluenten ist zu hoch/zu niedrig, was ist zu tun?

Der Fall Nehmen wir an, Sie haben festgestellt, dass für Ihre Probe die beste Trennung mit einer C18-Säule bei pH = 9,5 zu erzielen ist. Das ist zwar prima, doch Ihre Säule ist von diesem hohen pH-Wert wahrscheinlich nicht sonderlich begeistert (ab pH ≈ 8 löst sich Kieselgel auf). Die Säulenqualität würde schnell nachlassen. Natürlich könnte man nach einer geeigneteren Säule suchen, z. B. einer Hybridsäule oder einer auf Polymer- bzw. Aluminiumoxidbasis usw. Doch die Umstellung kostet Zeit und Geld, oder schlicht und ergreifend: Sie dürfen keine andere Säule verwenden! Eine Vorsäule könnte die Lösung sein. Manchmal wird jedoch nach...
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21. Juli 1995
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseEluentHPLC-Tipps

Methanol oder Acetonitril?

Der Fall ACN/H2O- und MeOH/H2O-Gemische sind die häufigsten Eluenten in der RP-HPLC. Kann es eine Präferenz geben? Was ist nun besser: ACN oder MeOH? Die Lösung Natürlich gibt es keine allgemeingültige Antwort, spezielle Selektivitätsunterschiede können sehr wichtig sein. Beispielsweise können einerseits bei bestimmten Substanzklassen Methanolate entstehen und ACN stabilisiert andererseits oktaedrische Cu2+-, Cd2+- und Zn2+-Komplexe. Nachfolgend werden einige generelle Unterschiede der zwei Lösungsmittel gegenübergestellt. Tab. 1: Vergleich zwischen Acetonitril und Methanol Das Fazit Offensichtlich sind die Vorteile von ACN den meisten Anwendern wichtiger als seine Nachteile, es wird in ca. 70 % der RP-Trennungen eingesetzt. Siehe auch Tipp „Methanol vs....
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21. Juni 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-Tipps

Wie entgase ich meinen Eluenten am besten?

Der Fall Unruhige Basislinie, starkes Rauschen und Druckschwankungen sind u. a. Hinweise dafür, dass Sie Ihren Eluenten überhaupt bzw. noch besser entgasen sollten. Wann ist dieser Schritt notwendig? Die Lösung Nachfolgend ist die Effektivität der vier wichtigsten Entgasungsmethoden für ein polares (Abb. 1. links, MeOH) und ein unpolares (Abb. 1 rechts, Hexan) Lösungsmittel dargestellt. Abb. 1: Effektivität von Entgasungsmethoden für ein polares (MeOH) und ein unpolares (Hexan) Lösungsmittel. (Quelle; J. W. Dolan, L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Human Press, 1989 Dazu folgende Bemerkungen: Auskochen ist nicht praktikabel Entgasung mittels Vakuum ist eine gute Methode. Sie erfolgt oft in einem...
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21. Mai 1995
ACNC - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsSpülen, Reinigen & Equilibrieren

Wie entferne ich organische Verunreinigungen schnell von einer RP-Phase?

Der Fall Stark organische Substanzen (Lipide, große Moleküle etc.) können an RP-Phasen, insbesondere C18, regelrecht ,,kleben“ bleiben. Das Ergebnis ist manchmal ein hoher Rückdruck und fast immer eine Verschlechterung der Trennung. Es kann zu der Bildung von breiten und tailenden Peaks oder auch Geisterpeaks kommen. Man müsste also mit MeOH oder ACN spülen. Das bedarf aber eines gewissen Aufwands und die Zeit ist oft knapp. Was tun? Die Lösung Injizieren Sie 100 μl oder 200 μl MeOH oder ACN. (Überprüfen Sie vorher, ob durch die ACN-Injektion in pufferhaltigen Eluenten kein Niederschlag entsteht!). Sollten sich organische Substanzen an der RP-Oberfläche befinden,...
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21. April 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseChromatogrammHPLC-TippsStationäre PhaseVeränderung des Chromatogramms

Warum kann ich polare Substanzen an der einen C18-Säule ver­nünftig trennen und an der anderen kaum?

Der Fall Sie möchten polare Substanzen mittels RP-Chromatographie trennen. Nehmen wir an, es handelt sich dabei um Säuren, und Sie möchten mehrere Säulen auf ihre Eignung testen. Natürlich machen Sie es richtig und wählen „gute“ Kandidaten, d. h. nachsilanisierte Phasen.* Trotz Ihrer überlegten Wahl erhalten Sie bei gleichen chro­matographischen Bedingungen (Eluent, pH-Wert, Temperatur etc.) mit einer Säule vernünftige Chromatogramme, während eine zweite, ebenfalls nachsilanisierte („endcappede“) Säule tailende Peaks liefert. Warum? *Anmerkung: Nachsilanisierte C18-Phasen sind geeignet zur Trennung von polaren Substanzen – jedenfalls was die Peakform betrifft … Das Kiesel­gel wurde nach der Umsetzung mit dem C18-Alkylsilan, zur Herstellung der RP-Phase,...
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19. März 1995
B OptimierungHPLC-TippsNicht berücksichtigenSäuleSäulenauswahl

Ist diese C18-Säule für meine Probe prinzipiell geeignet?

Der Fall Bei der Vielzahl an C18-Säulen heute auf dem Markt wäre es unökonomisch, die eine oder andere C18-Säule bei einer neuen Fragestellung auf „gut Glück“ auszutesten. Wenn tatsächlich keinerlei Informationen vorliegen, sollte man versuchen, die Auswahl einzuengen. Dazu gibt es einige Regeln. Die Lösung Folgende Substanzeigenschaften der Probe sind für die ersten Entscheidungen hilfreich: Löslichkeitsverhalten Chemische Natur Molekulargewicht Zunächst sollte entschieden werden, ob für Ihre Probe eine C18-Säule auf Kiesgelba­sis in einem klassischen RP-System grundsätzlich in Frage kommt. Anschließend können bestimmte Säulen anhand der Substanzeigenschaften aussortiert werden, und andere wiederum sollten als Kandidaten im Auge behalten werden. Tab. 2.1:...
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19. Februar 1995
C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine HinweiseHPLC-TippsSäuleStationäre Phase

Was kann ich dem Namen eines Säulenfüllmaterials entnehmen?

Der Fall Schauen wir uns die Sache erst einmal bei den Autos an, betrachten wir einige „historische“ Modelle: Beim ,,Cinquecento“ wissen wir, es handelt sich um den kleinen Italiener mit 500 ccm, bei der wilden ,,Ente“, 2 CV, ist die Rede von zwei ,,Pferden“ im Motor, bei ,,quadro“ haben wir es logischerweise mit einem Allradantrieb zu tun. KA, MOKKA und SMART sind dagegen pfiffige Namenskreationen, die nichts über Eigenschaften und Spezifikationen verraten. Ähnlich ist es auch bei den HPLC-Materialien. Was lassen uns die Hersteller wissen? Die Lösung Es gibt Materialbezeichnungen ohne jegliche Informationen, z. B. INTERCHROM, ASAHIPAK, und andere, die...
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18. Januar 1995
B OptimierungHPLC-TippsOptimierungpH-Wert des Eluentenpolare KomponentenSäulenauswahl

Trennung von ionischen Substanzen – wann ist was besser: Endcappede Phasen, inerte Phasen, Phosphatpuffer oder Ionenpaarreagenz? Teil I

Der Fall Einige, mehrere oder alle Peaks in Ihrem Chromatogramm eluieren mit einem Tailing. Die Gründe können vielfältig sein: Säulenüberladung, keine optimale Parametereinstellung am Detektor (z. B. Zeitkonstante, Datenrateaufnahme), größeres Totvolumen im System. Oder hängt es letzten Endes doch mit der Säule zusammen? Nehmen wir an, Sie können die ersten drei Fälle als Ursachen ausschließen und das Totvolumen Ihrer Anlage ist auch in Ordnung. Dann betrifft es doch die Säule. Die Frage ist nur: Was genau an der Säule? Wie kann man das überprüfen und was sind schließlich die notwendigen Maßnahmen? Die Lösung Wenn die oben beschriebenen Fälle als Ursachen...
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19. Dezember 1994
AuflösungB OptimierungBodenzahlFlussHPLC-TippsOptimierung

Welcher Fluss ist optimal für mich?

Der Fall Vorbemerkung: Nachfolgende Ausführungen beziehen sich aus praktischer Sicht im Wesentlichen auf isokratische Trennungen. Die Theorie der HPLC gilt sehr wohl auch für Gradiententrennungen, jedoch spielt der Fluss dort eine gänzlich andere Rolle, siehe dazu diesen HPLC-Tipp. Die Fließgeschwindigkeit beeinflusst die Trennung in der HPLC, denn von ihr hängt die Retentionszeit und die Trennleistung (Bodenzahl, Effizienz) einer Säule ab. Durch eine Abnahme des Flusses eluieren die Peaks später und der Abstand dazwischen vergrößert sich. Eine Flusserhöhung bewirkt genau das Gegenteil. Der Zusammenhang zwischen Fluss und Säuleneffizienz wird durch die Van-Deemter-Kurve wiedergegeben siehe Abb. 1. Abb.1: Die Abhängigkeit der theoretischen...
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18. November 1994
AuflösungB OptimierungBodenzahlHPLC-TippsOptimierungPeaks vor - oder nahe - der Totzeit

Totzeit, Kapazitätsfaktor, Selektivitätsfaktor . . . Kann man in der Praxis etwas damit anfangen?

Der Fall Fast in jedem HPLC-Buch wird auf diese Begriffe aus der Theorie der HPLC eingegangen. Fühlt sich jeder Autor irgendwo der HPLC-Theorie verpflichtet oder kann man als „normaler“ Mensch mit diesen Dingen tatsächlich etwas anfangen? Die Lösung Ja, ich denke entschieden ja! Die Reihenfolge einer vernünftigen Vorgehensweise bei der Optimierung in der Sorptions-HPLC lautet prinzipiell: 1) Optimalen k-Bereich einstellen („vernünftige“ Wechselwirkungen/Retention überhaupt) 2) Selektivität verbessern (unterschiedlich stark Wechselwirkungen der zu trennenden Komponenten) 3) Effizienz erhöhen („gute“ Peakform) Aus einem Chromatogramm erkennt man oft, in welchem Stadium der Optimierung man sich befindet. Siehe dazu nachfolgende Tabelle. Der Einfachheit halber gehen...
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17. Oktober 1994
AuflösungB OptimierungBodenzahlHPLC-TippsVeränderung der Retentionszeit

Wie kann ich meine Trennung optimieren?

Der Fall Der Leser möge es mir nachsehen, dass die Frage hier bewusst ungenau formuliert wurde, um exakt darauf hinzuweisen. Bevor ich mit der Optimierung beginne, muss sich genau definieren, was ich denn optimieren möchte. Bei einer Trenntechnik wie der HPLC bedeutet Optimierung in der Regel folgendes: Ich will den Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis vergrößern, d. h. die Auflösung erhöhen => besser trennen Ich will die Retentionszeit verkürzen => schneller trennen Ich will die Nachweisgrenze erniedrigen => mehr sehen Mit der Erniedrigung der Nachweisgrenze und der Verkürzung der Retentionszeit beschäftigen sich dieser (Nachweisgrenze) und dieser (Retentionszeit) Tipp....
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16. September 1994
B OptimierungHPLC-TippsVeränderung der Retentionszeit

Wie kann ich schneller trennen?

Der Fall Nehmen wir an, Ihnen ist eine Trennung gut gelungen. Vielleicht ist die Auflösung sogar viel zu gut. Das ist zu erkennen an dem unnötig großen Abstand zwischen den interessanten Peaks. Oder es dauert sehr lange zwischen Injektion und Elution des ersten Peaks. Der nächste vernünftige Schritt wäre, eine ausreichend gute Trennung bei verkürzter Retentionszeit zu erzielen. Welche Möglichkeiten gibt es dafür? Die Lösung Nachfolgend sind einige einfache und auch etwas aufwendigere Maßnahmen aufgeführt: Maßnahmen zur Erniedrigung der Retentionszeit Kürzere Säule; z. B. liefert eine 100 mm-Säule mit 3 µm-Teilchen und der gleichen stationären Phase eine ähnliche Trennung wie...
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15. August 1994
B OptimierungEinstellparameterHPLC-Tippskleine PeaksNachweisgrenzeNicht berücksichtigen

Problem Nachweisgrenze: Wie kann ich mehr sehen?

Der Fall Ein Peak, der etwa folgendermaßen aussieht: … ist sicherlich keine Wonne. Wie könnte man die Nachweisgrenze erniedrigen, was gleichbedeutend wäre mit einer Verbesserung des Peak/Rauschen-Verhältnisses? Die Lösung Es gibt glücklicherweise eine Reihe relativ leicht zu realisierenden Maßnahmen, die hier schnell zu einem besseren Ergebnis führen. Die einfachsten sind mit einem · versehen, siehe Tab. 1. Tab. 1: Maßnahmen zur Erniedrigung der Nachweisgrenze Das Fazit Wenn Sie ein(e) gelegentlicher(e) oder ständiger(e) Kämpfer(in) im Spurenbereich sind, sind optimale chromatographische Parameter für Sie viel wichtiger als für ,,normale“ Sterbliche. Hier einige Möglichkeiten: Dünne Säulen oder sogar Kapillaren Core Shell (1,3 µm)...
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14. Juli 1994
B OptimierungBodenzahlChromatogrammHPLC-TippsNachweisgrenze

Wie kann ich die Bodenzahl erhöhen?

Der Fall Hohe Bodenzahl einer Säule bedeutet, dass scharfe Peaks zu erwarten sind. D. h., bei einer gegebenen Selektivität wird die Auflösung durch die scharfen Peaks verbessert, da Auflösung der Abstand zwischen den Peaks und nicht zwischen den Peakspitzen bedeutet. Es gilt also, eine große Bodenzahl anzustreben, um eine bessere Trennung zu erreichen. Wie geht das? Die Lösung Bemerkung: Bandenverbreiterung und Tailing können als Ursachen auch Säulenüberladung und zusätzliche ionische Wechselwirkungen bzw. welche mit einer metallischen Oberfläche haben. Das wird hier ausgeschlossen. Die hier angesprochenen möglichen Maßnahmen betreffen die Säule selbst, die Apparatur und die chromatographischen Einflussgrößen. Nachfolgend eine Zusammenfassung...
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13. Juni 1994
B OptimierungEluentHPLC-TippsMethodenentwicklung, -Transfer und -OptimierungOptimierungPeaks vor - oder nahe - der TotzeitpH-Wert des Eluentenpolare KomponentenVeränderung der Retentionszeit

Meine Peaks kommen zu früh – wie kann ich sie in einem RP-System nach hinten verschieben?

Der Fall Angenommen, Ihre Peaks kommen in einem C18-ACN/H2O- oder MeOH/H2O-System viel zu früh, sagen wir irgendwo zwischen Totzeit und zweifacher Totzeit. Wenn Sie die Säule nicht überladen haben, dann liegt der Grund wohl darin, dass Ihre Substanzen sehr polar oder sogar ionisch sind. Wie können Sie nun die Retentionszeit erhöhen? Die Lösung Nachfolgend einige Möglichkeiten: Erster Fall: k-Werte (Retentionsfaktoren, relative Retention) sollen konstant bleiben; ,,Chemie“ bleibt konstant, d. h. die Wechselwirkungen mit der stationären Phase ändern sich nicht. Maßnahme: Säulenlänge erhöhen, Fluss erniedrigen Zweiter Fall: Änderung der k-Werte, d. h. es erfolgt ein Eingriff in die Wechselwirkung Substanz-stationäre Phase:...
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12. Mai 1994
Auto-SamplerB OptimierungBodenzahlHPLC-TippsProbengeber

Wie kann ich bei der Injektion für schmalere Peaks sorgen?

Der Fall Bei einer Trennung schmale Peaks zu erhalten ist unser aller Wunsch. Wie kann man diesem Wunsch näher kommen? Dazu gibt es mehrere Möglichkeiten. Es können zum einen effizientere Säulen verwendet werden, das ergibt eine höhere Bodenzahl. Auch alle Möglichkeiten, die zu einem verbesserten Peak/Rauschen-Verhältnis führen, siehe diesen Tipp, sind genauso gut zu nutzen. Hier wollen wir uns mit dem Einfluss der Injektion auf die Peakform befassen. Wir setzen voraus, dass die Säule nicht überladen und die Probe gut löslich ist. Die Lösung In der Säulenchromatographie herrscht ein mehr oder weniger laminarer Fluss. Gerade ein solcher bewirkt die Entstehung...
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11. April 1994
B OptimierungEinstellparameterHPLC-TippsVeränderung des Chromatogramms

Wie beeinflussen die Einstellungen am PC meine Auflösung?

Der Fall Die Trennung erfolgt zwar in der Säule, aber ,,sehen“ können wir sie erst auf dem Bildschirm. Bei dem üblichen 1-V-Ausgang bei älteren Detektoren sind die Einstellparameter am PC verantwortlich sowohl für die rein optische Darstellung des Chromatogramms auf dem Bildschirm als auch für die gewonnene Information. Was wäre zu beachten? Die Lösung Moderne Softwareprogramme bieten sehr viele Möglichkeiten, das Chromatogramm zu ,,manipulieren“. Z. B. automatische Basislinien-Subtraktion, programmierte Änderung der Integrationsparameter nach Ihren Vorgaben, Auto-Zero-Funktion und automatische Skalierung, automatische Kalibrierung bei nichtlinearem Signal/Konzentrationsverhältnis usw. Es lohnt sich, diese Möglichkeiten zu kennen und bei Bedarf einzusetzen. Die drei Grundeinstellungen, die...
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10. März 1994