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Chromatogramm Archive - Dr. Stavros Kromidas

Warum macht nur ein Peak Probleme? (II)

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (I)

Von A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie wenden eine Routinemethode an, alle Peaks im Chromatogramm verhalten sich wie von Ihnen erwartet: Die Retentionszeit bleibt konstant, die Peakfläche ebenso und die Peakform ist soweit OK. Nur ein (oder zwei) Peak(s) macht(en) Probleme, z. B: Nur dieser eine Peak ist breit und/oder seine Fläche ändert sich permanent und/oder evtl. ändert sich auch seine Retentionszeit. Was kann die Ursache sein? Die Lösung Wir beginnen mit dem, was nicht sein kann: Nachdem die übrigen Peaks sich „anständig“ verhalten, können wir alle Substanz-unspezifische Faktoren (die ja alle Peaks betreffen würden – mal stärker, mal schwächer, aber eben alle) ausschließen:…

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Der Einfluss des Probelösungsmittels auf das Chromatogramm

Von A Fehlersuche, Doppelpeaks, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Probenlösungsmittel, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Ist die Probelösung nicht identisch mit der mobilen Phase (bzw. mit der Anfangszusammensetzung vom Eluent A bei der Gradientelution) kann dies einen Einfluss auf das Chromatogramm haben. Wie macht sich das nun genau bemerkbar? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: „Andere“ Probelösung kann vielerlei bedeuten: Andere Zusammensetzung, anderes organisches Lösungsmittel, anderer pH-Wert, andere Pufferstärke/anderes Salz etc. Konzentrieren wir uns auf die RP-Chromatographie und betrachten folgende drei Fälle: Die Probelösung kann polarer, apolarer oder einfach „anders“ als der (Anfangs-)Eluent sein. 1. Polarer – also im Sinne der RP-Chromatographie schwächer Diese Situation sollte stets angestrebt werden, denn: Wenn…

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Peaks auf einer Flanke – mögliche Konsequenzen und Maßnahmen

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Integration, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Manch´ ein Peak eluiert auf einer Flanke. Die Flanke kann u.a. ein abfallender Gradient, ein sehr langsam eluierender Peak oder einfach Matrix sein. Angenommen, das Problem ist chromatographisch nicht zu lösen, wie könnte man vorgehen, um den Fehler bei der Bestimmung der Peakfläche zu minimieren? Die Lösung Im Falle vom Gradienten haben wir an dieser Stelle bereits darüber gesprochen, wie eine Lösung aussehen könnte: Blindgradient bzw. das Chromatogramm einer Matrixinjektion (Matrixlösung ohne Probe) vom Original-Chromatogramm abziehen und das Differenz-Chromatogramm integrieren. Hier möchte ich kurz auf zwei etwas anders gelagerte Fälle eingehen. Fall 1 In Abb. 1 sind sechs…

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Fluss, Peakhöhe und Peakfläche

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Detektor, HPLC-Tipps, LC-MS-Kopplung, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Wenn der Fluss sich ändert, ändert sich auch die Peakform – mal stärker, mal schwächer. So weit so gut. Was machen nun die Peakhöhe und die Peakfläche? Ändern sie sich ebenso und wenn ja, ist dies merklich? Was wären schließlich die Konsequenzen? Die Lösung Es muss grundsätzlich zwischen Konzentrations- und Massen-empfindlichen Detektoren unterschieden werden: Der UV- (UV-Vis, DAD) und der Fluoreszenzdetektor beispielsweise sind Konzentrations-empfindliche Detektoren, der Massendetektor bei der LC/MS- bzw. LC/MS/MS-Kopplung ein Massen-empfindlicher Detektor. D.h. im ersten Fall ist das Signal von der Konzentration, im Zweiten von der Masse der Analyten abhängig. Bei einem Konzentrations-empfindlichen Detektor verändert…

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Die Auflösung – verschiedene Formeln, verschiedene Ergebnisse

Von Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps

Der Fall Die Auflösung ist – vereinfacht gesagt – der Abstand zwischen zweier Peaks an der Basislinie. Sie hängt von der absoluten Stärke der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Kapazität, Retentionsfaktor k), von dem Verhältnis der Wechselwirkungen der zwei Komponenten (Selektivität, Selektivitäts- oder Trennfaktor α) und von der Peakform (Effizienz, Bodenzahl N) ab. Die Auflösung wird als das wichtigste Kriterium für die „Güte“ einer Trennung angesehen. So wird oft eine Mindestauflösung verlangt, auch werden Auflösungen zum Methodenvergleich heran gezogen. Es ist nun so, dass es mehrere Formeln für die Auflösung gibt, die alle mehr oder weniger benutzt werden. Es liegt somit auf…

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Vom „Kult“ der Bodenzahlen… – oder was bewirkt eine hohe Bodenzahl?

Von Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Optimierung

Der Fall Seit einigen Jahren machen die sub 2 µm-Teilchen sowie die Fused Core (Core Shell) Materialien von sich reden. So wird gerne auf die hohen Bodenzahlen dieser Materialien hingewiesen und folglich auf die damit verbundene wesentlich bessere Trennung. Betrachten wir folgende zwei Beispiele: In der Publikation eines Herstellers steht: „Unsere Fused Core Säule X weist 264.800 Böden/m auf, die Säule Y von Firma Z mit porösen 1,8 µm-Teilchen lediglich 250.970 Böden/m“. In einer Zweiten ist die Rede von zwei Säulen, beide mit 1,7 µm-Teilchen gefüllt, die eine weist eine Bodenzahl von 318.690 Böden/m, die andere – die „schlechtere“ –…

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Sind ein kleines „Delay Volume“ der Apparatur und/oder ein kleines Volumen der Mischkammer immer „gut“? oder: Was ein Paar „Mikroliterchen“ alles bewirken können…

Von A Fehlersuche, Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Im Zuge der Verbreitung von UHPLC-Geräten warten die Hersteller mit immer kleineren Verweilvolumina (Verweilvolumen, auch: Verzögerungsvolumen, „Delay Volume“, „Dwell Volume“, das ist das Volumen von der Mischkammer bis zur Säule) bzw. Volumina der Mischkammer (35 – ca. 60 µl) auf. Da ist zunächst nichts dagegen einzuwenden. Kleine Volumina können jedoch auch Nachteile mit sich bringen. Dabei denke ich im Moment nicht an eine erhöhte Gefahr für Niederschläge im Falle von starken Puffern. Und auch nicht an eine schlechte Mischungsqualität imfalle von großen Unterschieden in der Viskosität der zu mischenden Lösungsmittel in Kombination mit einem kleinen Volumen der Mischkammer….

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Unterschiede in den HPLC-Anlagen – die Peakfläche

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Fluss, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Dass Geräte von unterschiedlichen Herstellern große Unterschiede aufweisen können, ist eine HPLC-Binsenweisheit. Der Unterschied kann im Verweilvolumen bei Gradientenanlagen liegen (Hochdruck vs. Niederdruck), in der Richtigkeit bei der Wellenlängeneinstellung (z. B. +/- 2 nm vs. +/- 4 nm), im Material der Nadel im Probengeber (z. B. Stahl vs. Keramik) und damit verbunden evtl. Memoryeffekte, in der unterschiedlichen Geometrie der Mischkammer oder der Detektorzelle bei u. U. identischem Volumen und, und…Diese Unterschiede sowie die Folgen sind erfahrenen AnwenderInnen bekannt: Unterschiede in der Retentionszeit, in der Peakfläche und in der Peakform. Im hiesigen Peak möchte ich gerne auf zwei Sachen…

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Integration von Peaks auf einer driftenden Basislinie

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Integration

Der Fall Bei Gradiententrennungen oder im Falle von Matrix-belasteten Proben müssen oft Peaks, die sich auf einer mehr oder weniger stark driftenden Basislinie oder auf einem flachen „Buckel“ befinden, integriert werden. Die Frage ist nun, wie tut man so etwas am besten? Da die meisten Anwender nicht über Peakhöhen auswerten, wird hier auf diese – oft sinnvolle – Möglichkeit nicht weiter eingegangen. Die Lösung Nachfolgend werden für zwei Fälle Lösungsansätze vorgeschlagen, die sich nach aufwendigen Überprüfungen als das kleinere Übel erwiesen haben (1). 1. Nicht-aufgelöste Peaks auf einer abfallenden Basislinie, s. Abb. 1. (Das Beispiel wurde freundlicherweise von Hans-Joachim Kuss…

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