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Die kleine Frage zur Validierung …

Von Allgemein, Einstellparameter, Monatstipp, Nachweisgrenze

„Wir haben bei der Bestimmung vom LOQ starke Schwankungen. Auch an unterschiedlichen Geräten und mit neuen Säulen. Woran kann das liegen? Als LOQ-Kriterium haben wir wie üblich ein S/N-Verhältnis von 10:1.“

Antwort:
Die Erfahrung zeigt, dass hier mit recht großen Integrationsfehlern zu rechnen ist.
Wir konnten zeigen (s. Infos am Ende des Beitrages), dass kaum eine kommerzielle Software in der Lage ist, bei automatischer Integration und einem S/N-Verhältnis von 10:1 so zu integrieren, dass der Fehler – bei optimalen (!) Bedingungen (BL-Trennung, kaum Drift usw.) – nicht mindestens 5-10 % beträgt. Siehe dazu weiter unten die Werte in der Tabelle für den ersten, kleinen Peak (oben): In den grau schraffierten Feldern befinden sich Werte mit einer Abweichung von mehr als 1 % vom richtigen Wert, bedingt durch eine fehlerhafte Integration.

 

Einige Kommentare und Erläuterungen zu den Werten der Tabelle:

  • Die verwendeten Einstellparameter („Settings“) wie Dwell-Time, Time Constant, Sample Rate usw. können – vor allem bei kleinen Peaks – die Integration beeinflussen. So ist beispielsweise die Abweichung vom richtigen Wert beim ersten Peak bei einem Threshold-Wert von 50 12,50 %, bei einem Threshold-Wert von 100 17,78 % (EZChrom)
  • Bei einigen Software-Programmen können unterschiedliche Integrationsalgorithmen angewandt werden. Die erhaltenen Ergebnisse können dabei recht stark abweichen, siehe z. B. die Werte der zwei Spalten bei Empower und Chromeleon (Waters, Dionex/Thermo). Das betrifft nicht nur absolute Abweichungen, es können sich sogar sowohl Unter- als auch Überbefunde ergeben
  • Erst ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 ist bei allen kommerziellen CDS (Chromatography-Data-Systems) der Integrationsfehler merklich kleiner 1 %

Fazit bzgl. Richtigkeit – wenn das Ziel zuverlässige Ergebnisse lautet:
– Bei symmetrischen, BL-getrennten Peaks liegt der Fehler durch die Integration erst
ab einem S/N-Verhältnis von ca. 50:1 gesichert unter 1 %
– Bei tailenden, Nicht-BL-getrennten Peaks – evtl. noch auf einer driftenden Basislinie –
ist ein S/N-Verhältnis von ca. 100:1 empfehlenswert.

Auch die Reproduzierbarkeit der Integration bei mehrfacher Injektion (Präzision) lässt bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 oft zu wünschen übrig.

Empfehlung bzgl. Reproduzierbarkeit von Ergebnissen am LOQ:
Injizieren Sie sechs Mal eine reale Probe und ermitteln bei einem S/N-Verhältnis von 10:1 den Variationskoeffizienten (VK, RSD, Relative Standard Deviation). Frage: Genügt der resultierende VK bei diesen chromatographischen Bedingungen an dieser Apparatur und bei diesen Settings Ihren Anforderungen? Wenn nicht, wäre das S/N-Verhältnis so lange zu erhöhen, bis dies der Fall ist. Diese Konzentration kann dann als gesichert reproduzierbares LOQ (Limit Of Quantification, Bestimmungsgrenze) angesehen werden, die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wäre somit gegeben: Ihre Software kann bei dieser Konzentration reproduzierbar integrieren. Ein möglicher systematischer Fehler („Unrichtigkeit“ der Peakfläche und somit des Gehaltes) bleibt natürlich unerkannt, siehe dazu weiter oben „Richtigkeit“.
Merke:
Das in einigen regulierten Bereichen (FDA, ICH etc.) etablierte S/N-Verhältnis von 10:1 als Kriterium für LOQ basiert auf Richtlinien, es sind keine unverrückbare/gesetzliche Vorgaben: Es handelt sich ja um „Guidelines“ und nicht um „Regulation“/“Legal Requirements“. Es zeigt sich, dass mit Begründung ein größeres S/N-Verhältnis als Kriterium für LOQ von Auditoren/Inspektoren durchaus akzeptiert wird.

Weiterführende Infos und Angebote zum Thema „Validierung“: Artikel, Dokumente, Definitionen, Beratung, Bücher, Kurse

1. September 2025

Die kleine Frage zur Validierung …

Von Allgemein, Jahrestipps, Nachweisgrenze

„Validierung ist aufwendig und teuer; was ist das Minimum an Validierung, was wir machen müssen?“ Zwei Vorbemerkungen Vor einer Antwort halten wir wie folgt fest: 1. Es gibt viele Definitionen zur Validierung, eine davon lautet: „Das Ziel bei der Validierung einer analytischen Methode ist zu zeigen, dass sie für den beabsichtigten Zweck geeignet ist.“ 2. Validierung ist – anders als z. B. GLP – kein Gesetz. Es gibt demnach de jure keine offizielle Stelle, die bzgl. Umfangs, Validierungstiefe, Durchführung, Revalidierungbedarfs etc. gesetzlich bindende Vorgaben macht. Somit jetzt schon einige Schlussfolgerungen: Validierung ist demnach etwas recht Individuelles: Um was geht es in einem aktuellen Fall eigentlich? Muss ich eher formale Sachen beachten, muss also eine wichtige Person/Organisation lediglich „nicken“? Oder stehen analytische Gesichtspunkte im Vordergrund, die notwendiger-/sinnvollerweise zu beachten sind? Sehr wohl ergibt sich häufig de facto aus bestimmten Zwängen/Gegebenheiten genau „was“, „wie“, und „wieviel“ an Validierung zu tun ist. Wenn ich diese Vorgaben missachte, bekomme ich beispielsweise keine Zulassung für mein Produkt bzw. kann ich besagte Methode gar nicht anwenden. Wenn ich solchen Zwängen nicht unterliege, kann ich selbst denken und dem „beabsichtigten Zweck“ gemäß handeln. Das heißt, ich suche aus der „Validierungsklaviatur“ (Richtigkeit, Präzision, Linearität, Robustheit etc.) diejenigen Validierungsparameter…

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7. August 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Das Nonplusultra zur Überprüfung der Peakhomogenität: Multidetektion und 2D-Chromatographie

Von B Optimierung, Chromatogramm, Detektor, Jahrestipps, LC-MS-Kopplung, Optimierung

Zusammenfassung Multidetektion und insbesondere 2D-Chromatographie sind die besten Tools, um Peakhomogenitäten zu überprüfen bzw. mittels letzterer die Auflösung zu verbessern. Der Aufwand jedoch bei der Etablierung einer 2D-HPLC sollte nicht unterschätzt werden. Ferner sind zwei Nachteile bei 2D-Anwendungen zu nennen: Mangelnde Robustheit und Verlust an Empfindlichkeit. Der Fall Beim letzten HPLC-Tipp haben wir uns den orthogonalen Test angeschaut: Eine gänzlich andere Säule und/oder ein gänzlich anderer Eluent sind sehr hilfreich, um die Peakhomogenität (Peakreinheit) zu überprüfen. Heute geht es um die in diesem Zusammenhang vermutlich zwei besten Tools: Stufe 1, recht einfach: Einsatz eines zweiten/dritten Detektors; Multidetektion ist mittlerweile in vielen Laboren eine Selbstverständlichkeit Stufe 2, recht aufwendig: „2D“ (2-dimensionale Chromatographie) anwenden; 3D gibt es zwar auch schon seit jeher – aber lassen wir es hier lieber … Was hat denn beides auf sich? Die Lösung Multidetektion Ein zweiter/dritter Detektor in Serie kann erstens Peaks detektieren, die bei Verwendung nur eines Detektors unsichtbar bleiben und zweitens Peaks, die schlecht abgetrennt sind, wenigstens als solche erkennen. In Abb. 1 wird die Verunreinigung bei 6,72 min nur mit MS (ESI-Positiv), jedoch nicht mit DAD erkannt (oberes Bild). Im ESI-Negativ-Modus (unteres Bild) ist zwar das Signal bei 6,72 min wesentlich größer, dafür fehlt…

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14. Juli 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Der orthogonale Test: Bester Test bzgl. Nutzen/Aufwand-Verhältnisses zur Prüfung der Peakhomogenität

Von ACN, Allgemein, Chromatogramm, Eluent, Jahrestipps, Lösungsmittel, Optimierung, Säule, Säulenauswahl, Stationäre Phase, Veränderung des Chromatogramms

Zusammenfassung: Orthogonaler Text: Verwende eine „ganz“ andere Säule (z. B. statt einer C18 nun eine PFP oder eine Mixed Mode) und/oder einen anderen Eluenten (mobile Phase statt mit ACN nun mit MeOH) und injiziere erneut. Ähnliche Substanzen gehen wahrscheinlich (etwas) andere Wechselwirkungen mit der stationären Phase ein. Somit offenbart sich, dass ein symmetrischer Peak evtl. doch nicht homogen ist. Der Fall In den letzten zwei HPLC-Tipps haben wir folgendes gesehen: Eine Änderung von Einstellparametern („Settings“) sowie „Manipulationen“ der Probelösung stellen schnelle Möglichkeiten dar, die Peakhomogenität zu prüfen. Heute geht es um den orthogonalen Test. Was ist das und was „bringt“ er? Die Lösung Am Ende einer Methodenentwicklung kommt häufig die Frage auf: „Habe ich alle Peaks trennen können, oder liegt womöglich irgendwo im Chromatogramm doch eine Koelution vor“? Jetzt kommt der orthogonale Test ins Spiel – die Idee dahinter: Man verwende eine völlig andere stationäre Phase oder einen anderen Eluenten und injiziert erneut. Es ist ziemlich unwahrscheinlich, dass zwei oder drei Komponenten bei Verwendung zweier gänzlich (!) unterschiedlichen Säulen bzw. Eluenten in beiden Fällen völlig gleich starke Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen. Wenn nun mit einem Eluenten an zwei unterschiedlichen Säulen oder mit zwei unterschiedlichen Eluenten an einer Säule…

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22. Mai 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Schnell durchzuführende Tests zur Prüfung der Peakhomogenität – im Focus heute: Die Probelösung (Diluent).

Von Allgemein, B Optimierung, Injektionsvolumen, Jahrestipps, Lösungsmittel, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel

Der Fall Wie beim vorherigen HPLC-Tipp geht es auch heute um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Beim letzten Mal haben wir gesehen, dass eine Änderung der Einstellparameter („Settings“) durchaus hilfreich sein kann. Heute steht die Probelösung im Focus: Schnell durchzuführende „Manipulationen“ bzgl. Probelösung können ebenso helfen. Welche wären das? Die Lösung Verdünne die Probelösung oder injiziere weniger Wir alle überladen öfters als gedacht die „arme“ Säule. Ergebnis: Verschlechterung der Auflösung. Eine lokale Überladung der Säule macht sich vor allem am Anfang des Chromatogramms bemerkbar; dort eluieren in einem RP-System polare Komponenten, die zusätzliche polare Wechselwirkungen mit der Oberfläche der stationären Phase eingehen können („Dualer Mechanismus“). Die Devise lautet: Probelösung, also Diluent, einfach mit Wasser verdünnen oder vielleicht noch einfacher: Weniger injizieren. In Abbildung 1, rechts, wird die Injektion von 20 µl Acetophenon gezeigt: Der erste Peak ist eine Verunreinigung, der zweite die Hauptkomponente Acetophenon. Anschließend wurde lediglich Eluent injiziert, linkes Chromatogramm. D.h. hier wurde der Memory-Effekt ausgenutzt: Es befindet sich häufig ein kleiner Rest der Probe an der Nadel, der nicht immer 100% weggespült wird. Wie man leicht erkennt, ist die Verunreinigung sauber, Acetophenon dagegen nicht: Auch mit 20 µl kann eine…

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7. April 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Einfache Tests zur Prüfung der Peakhomogenität

Von Auflösung, B Optimierung, Chromatogramm, Einstellparameter, Jahrestipps, LC-MS-Kopplung, Nachweisgrenze, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Im HPLC-Tipp vom letzten Dezember war Peaky am Zweifeln, ob er es wirklich ist: „Bin ich überhaupt der Peaky? Und wenn ja, wieso fühlt es sich so an, als wäre ich mehrere …“ Es geht also um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Im vorliegenden HPLC-Tipp werden wir uns einfache Tests anschauen, die recht schnell durchzuführen sind: Keine Änderung der chromatographischen Parameter, keine Änderung der Apparatur. In den nächsten HPLC-Tipps werden wir uns sukzessiv mit aufwendigeren Methoden beschäftigen. Die Lösung Eine Veränderung von Einstellparameter („Settings“) kann helfen, innerhalb von Sekunden/Minuten die Peakhomogenität zu überprüfen. Es lohnt sich (auch) an solche „banale“, schnelle Möglichkeiten zu denken: Injektion bei einer anderen (niedrigeren) Wellenlänge, siehe Abbildung 1: Bei 271 nm erscheint der dritte Peak als ein Peak (unteres Chromatogramm), bei 225 nm sind zwei Peaks zu erkennen (oberes Chromatogramm)   2. Eine große Zeitkonstante („Filter Response“, „Filter Time Constant“) führt zwar zu einer ruhigeren Basislinie, die Peakbreite nimmt allerdings zu, man verliert an Auflösung. Folgendes Zahlenbeispiel aus einer „Technical Note“ von Waters, die freundlicherweise von Sascha Schifrin zur Verfügung gestellt wurde: Kein digitales Filtern: Auflösung (Resolution) 3,16, Peakkapazität 16 Zeitkonstante, 0,5 Min: Auflösung 1,82,…

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19. Februar 2025

Wahre HPLC-Geschichten zum Schmunzeln: Müßiggang, Wundersäule, „DL-Benzol“

Von Doppelpeaks, kleine Peaks, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Lassen Sie uns das neue Jahr etwas entspannt und locker angehen; der erste HPLC-Tipp des Jahres 2025 beschreibt drei, sagen wir, „spezielle“ Situationen aus dem echten HPLC-Leben. „The Beauty of Slowness“ Ein Labor beim deutschen Mutterkonzern hat viele Proben zu messen, die‘ Geräte laufen rund um die Uhr, die Anwenderinnen sind froh, dass sie das Probenaufkommen gerade noch bewältigen. Im Labor eines Tochterunternehmens in einem anderen Kontinent, welches die gleiche HPLC- Methode anwendet, herrscht eine etwas andere Arbeitskultur: Jeden Freitagnachmittag lässt man die Arbeitswoche mit ausgiebigem Plaudern bei Kaffee und Kuchen ausklingen, die restlichen Proben können ja ruhig am Montag fertig gemessen werden… Während der geselligen Zeit allwöchentlich freitags werden allerdings die Geräte immer sehr lange, sehr gründlich mit heißem Wasser und Isopropanol gespült, diese Lösungsmittel (manchmal auch zusätzlich 0,01 N HNO3 und DMF) werden auch mehrmals injiziert. Im ersten Labor: „Buckel“ in der Basislinie, Geisterpeaks, Memory-Effekt. Im Zweiten: Null Probleme; Gerät, Autosampler und Säule werden ja regelmäßig gründlichst gespült, allerlei Verunreinigungen verlassen zwangsläufig das Gerät – gemütliche Zeit während der etwas Vernünftiges passiert, ist eine doppelt gewinnbringende Zeit. Merke: Im Falle einer schwierigen Matrix (Salbe, Tween, Cellulose, Lipide usw.) bleibt ein gründliches Spülen der Anlage inkl. Säule mit Lösungsmitteln…

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12. Januar 2025

HPLC und KI mal „anders“: Ein Gespräch zwischen Peaky und Chromy

Von Bodenzahl, Chromatogramm, Peakverbreiterung, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

„Wer bin ich? Und bin ich allein? Und wieso verändere ich mich? (Peaky ist ein kleiner, unruhiger, quirliger Peak, häufig als „Nervensäge“ unterwegs. Chromy dagegen ist ein großer, gemütlicher Peak aus der Nähe von Hydrophobenhausen, in der Regel cool, fast apathisch. Sie sitzen heute wieder im Karussell am aller letzten Platz und warten bis sie injiziert werden, haben also genügend Zeit für ein Schwätzchen) Die Probleme von Peaky Chromy: Peaky, was ist los mit dir, warum bist du so down? Peaky: Ich bin am Zweifeln: Bin ich überhaupt der Peaky? Und wenn ja, wieso fühlt es sich so an, als wäre ich mehrere und wieso gehe ich so auseinander, mein Gewicht bleibt doch gleich? Chromy: Also, ich kann dir garantieren, du bist es und du bist allein, das sehe ich doch … Peaky (energisch): Dein Freund DAD behauptet es auch. Am Freitag hat er auch nur einen Peak gesehen, aber neben 2-Nitroanilin waren auch 20 % 4-Nitroanilin dabei… Chromy: Ja, aber … Peaky (schon etwas erregt): Nix aber! Es geht um MICH Mann, es geht um Wahrheit, kein formales Alibi-Zeugs und so! Chromy: Beruhige dich doch… Peaky: NEIN! Chromy: Aber ich kenne dich und ich sehe dich und … (Peaky…

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30. November 2024

Metallionen in der HPLC: „Schlimm“? Und wenn ja, wie schlimm?

Von A Fehlersuche, ACN, Apparatur, Bodenzahl, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Veränderung des Chromatogramms

Der Einfluss von Metallionen in der HPLC ist schon seit Längerem bekannt; sprechen wir eher von einem zwar vorhandenen, jedoch bis dato bei vielen Anwender:innen weniger sich stark im Focus befindenden Problem. In den letzten Jahren erlebt dieses Thema allerdings aufgrund der zunehmenden Wichtigkeit von Biomolekülen eine gewisse Renaissance. Um welche Metallionen handelt es sich? Wo kommen sie her und was bewirken sie? Sind sie vermeidbar? Und: Können sie entfernt werden? Doch bevor wir uns dem Thema widmen, zunächst ein kleiner semantischer Exkurs: Konfusion von Begrifflichkeiten Begriffe im hiesigen Zusammenhang werden nicht von allen Beteiligten einheitlich verwendet. Dadurch entsteht eine gewisse Konfusion. Nachfolgend eine kurze Einordnung, wobei diese weder den Anspruch auf Vollständigkeit erhebt, noch kann ich erwarten, dass alle mit dieser 100 % d’accord gehen. Bioinert; geringe Wechselwirkungen mit Hardware-Komponenten, geringes Risiko für carryover; ältester Begriff, bereits 1933 verwendet: Aluminium-Oberfläche als Alternative zu Eisen. Im Umfeld der HPLC sind die verwendeten Materialien hier Titan, Keramik, PEEK Biokompatibel; keine Korrosionsgefahr trotz Chlorid-Ionen im Eluenten; oft synonym bzw. gleich zu setzen mit Bio-LC und Stainless steel-free; verwendete Materialien: Titan und spezielle Legierungen, z. B. MP35N Metall-frei; verwendete Materialien: PEEK, Saphir Weitere anzutreffende Attribute sind: „Inert“, „truly bioinert“ (PEEK), schließlich „fully biocampatible“….

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9. Oktober 2024

Kriterien bei Systemeignungstests (SST) in der HPLC

Von Allgemein, Bodenzahl, Systemeignungstest (SST), Variationskoeffizient (Vk)

Der Fall Pragmatismus hilft oft – auch in der HPLC: Wenn alle Beteiligte (Anwender:innen, Labormanagement, Kunde, Auditor/Inspektor) mit den vorgegebenen Kriterien resp. SST-Anforderungen (SST: System Suitability Tests, Systemeignungstests) zufrieden sind, besteht kein dringender Handlungsbedarf. Wenn allerdings häufig OOS-Situationen auftreten oder das Aufwand/Nutzen-Verhältnis aus praktischer Sicht nicht wirklich überzeugend erscheint, sollten – sofern es realistisch Sinn macht – die aktuellen Kriterien hinterfragt werden. Welche SST-Kriterien sind sinnvoll? Die Lösung Halten wir vereinfacht wie folgt fest: Bei einem SST geht es darum zu überprüfen, ob diese Methode „hier und jetzt“ an diesem Gerät nach vorgegebenen Kriterien funktioniert. Bemerkung: Die Frage, ob für einen SST eine Standard-Lösung oder eine „reale“ Probelösung – also eine Lösung, die bzgl. Konstitution, Konzentration, Matrix etc. den Proben entspricht, die gleich vermessen werden – verwendet werden soll, lassen wir hier außen vor. Nun, die HPLC ist eine Trenntechnik; die zwei Hauptziele sind i.d.R.: 1. Genügend gute Trennung inkl. Identifizierung und damit zusammenhängend eine gesicherte qualitative Information: „Ich sehe alle mich interessierende Analyten/Peaks“ 2. Gesicherte quantitative Information: „Wie reproduzierbar ist die Integration und demnach die Ermittlung der Peakfläche der mich interessierenden Peaks?“ Und: „Ist der Wert überhaupt richtig?“ In den meisten Fällen liegt der Focus auf beides: „Ich will…

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20. August 2024