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Wenn schon Druck, dann wenigstens so, dass es für Dich lohnt…

By B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall UHPLC-Anlagen erlauben hohe Drücke. Solche ergeben sich, wenn beispielsweise eine lange oder eine dünne Säule und/oder kleine Teilchen verwendet werden oder aber wenn bei niedrigen Temperaturen gearbeitet wird. Mit dünnen Säulen wird eine gute Massenempfindlichkeit erzielt, eine niedrige Temperatur ist oft hilfreich bei der Trennung von Enantiomeren oder Isomeren. Wenden wir uns zunächst dem Ziel, „besser trennen“, zu. Nehmen wir an, in einem gegebenen Fall ist eine Verbesserung der Auflösung über die Selektivität kaum möglich, da unsere Probe zwei sehr ähnliche Komponenten enthält. Hier ist eine Verbesserung der Auflösung nur über eine höhere Bodenzahl zu realisieren, eine solche…

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20. November 2014

Sinnvolle Säulentests abhängig von der Zielsetzung

By Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Stationäre Phase, Systemeignungstest (SST)

Der Fall Die wenigsten Anwender führen Säulentests durch – wenn doch, dann wird oft die Bodenzahl ermittelt, man interessiert sich für die Frage: „Ist die Säule noch „gut“?“. Die Mehrzahl führt eher einen Systemeignungstest (SST) durch, in diesem Fall ist die Säule ein Teil des „Gesamtsystems“. Dennoch kommen oft Fragen bzw. Zweifel auf, in etwa: „Reicht das, was wir machen?“ oder: „Wann ist die Säule nicht mehr zu gebrauchen?“ Mit diesen Fragen wollen wir uns hier beschäftigen. Die Lösung Säulentests können Informationen zu folgenden Attributen einer HPLC-Säule liefern: 1. Trennleistung (Sprich: Packungsqualität), 2. Eigenschaften der stationären Phase, 3. Selektivität/Eignung für…

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20. Oktober 2014

Die „Kleinen“ im Sommer

By HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, Totvolumen, Uncategorized

Resultierender Druck „Fuß“ am Peakende Core Shell (Fused Core)-Material Wann ergibt sich welcher Druck? Bei einer Änderung der Dimensionierung von Säulen bzw. Kapillaren sowie der Teilchengröße ändert sich der Druck. Nahezu alle Hersteller bieten EXCEL-Makros an, mit deren Hilfe der sich ergebende Druck bei einer Änderung von… rechnerisch ermittelt wird. Dennoch möchte ich hier gerne anhand einiger Zahlenbeispiele auf 1-2 Sachen hinweisen, um anschließend zu einem Resultat zu kommen. Merke: Der Druck verhält sich mit der Säulenlänge linear, mit dem Innendurchmesser der Säule sowie dem Teilchendurchmesser quadratisch und mit dem Innendurchmesser einer Kapillare in der vierten Potenz. Das heißt beispielsweise:…

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20. September 2014

Die „Kleinen“ im Sommer

By A Fehlersuche, Detektor, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Uncategorized, Verweilvolumen

„Dreck“ bzw. Matrix mal anders… „Dreck“ in einer HPLC-Anlage ist unangenehm, jener kann unterschiedlichen Ursprungs sein: Matrixbestandteile, Verunreinigungen aus der Probelösung oder dem Eluenten, Polymere aus dem Acetonitril, Kontaminationen aus dem Gerät etc. Eluiert der „Dreck“ einmalig oder unregelmäßig mit der mobilen Phase, lauten die üblichen Probleme: Geisterpeak(s), „Buckel“, „Wellen“, „Gebirge“ in der Basislinie, verstärktes Rauschen. Haftet er jedoch irreversibel oder auch länger an diversen Oberflächen wie Fritten, Injektionsnadel, Septum, Verbindungsstücke, „column saver“ (on-line Filter vor der Vorsäule) etc., müssen wir in diesem Fall mit einer weiteren Konsequenz rechnen: Memoryeffekt bzw. Retentionszeitverschiebung. Nachfolgend zwei Beispiele zur Retentionszeitverschiebung: In PV´ s…

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20. August 2014

Die „Kleinen“ im Sommer

By A Fehlersuche, Geisterpeaks & negative Peaks, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Spülen, Reinigen & Equilibrieren, Totvolumen, Uncategorized, Veränderung des Chromatogramms

Peaks eluieren früher und ihre Peakbreite hat zugenommen – eine mögliche Ursache: Wir gehen davon aus, dass weder die Packungsqualität noch eine Verschiebung des pH-Wertes als Ursache infrage kommt. Der Grund könnte u.a. Schmutz an der Oberfläche der stationären Phase sein. Tritt dieser Fall ein, so ist ein Teil der aktiven Zentren belegt, die Wechselwirkungen nehmen ab, die Peaks eluieren früher. Ferner führt die geringer gewordene Zahl der aktiven Zentren, die für eine Wechselwirkung mit den zu trennenden Komponenten nun zur Verfügung stehen, zu einer lokalen Überladung der Säule. Das ist die Ursache für die Peakverbreiterung. Auf der Seite der…

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20. Juli 2014

Die „Kleinen“ im Sommer

By Behältnisse, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Geisterpeaks & negative Peaks, Gradient, HPLC-Tipps, pH-Wert des Eluenten, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche

  Ein paar Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen Änderung der Peakform und der Peakfläche durch ungewollte Änderung des pH-Wertes Wiederfindung abhängig von der (Glas)Oberfläche In diesem Tipp haben wir bereits einige Unterschiede zwischen isokratischen und Gradiententrennungen besprochen,  auch hier wurde das Thema behandelt. Nun, weiter unten einige Weitere: Retentionszeit bei isokratischen Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Abnahme der Retentionszeit um Faktor 2 Retentionszeit bei Gradienten-Läufen: Halbe Säulenlänge oder doppelter Fluss: Natürlich ebenso Abnahme der Retentionszeit, allerdings abhängig von mehreren Faktoren lediglich um ca. 10-30% Und überhaupt: Die Retentionszeit wird bei Gradientenläufen vom Start- und End % B sowie von…

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20. Juni 2014

Benutze deine UHPLC in diesen Fällen lieber nicht als UHPLC…

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, UHPLC und Miniaturisierung

Der Fall Die LC-Anlage von heute ist eine UHPLC. Die UHPLC hat zweifelsohne Vorteile; so sind beispielsweise Anwender zufrieden ob der kurzen Läufe, der „guten“ Trennungen und des geringen Lösemittelverbrauchs. Möchte man nun seine UHPLC wirklich unter UHPLC-Bedingungen betreiben (z. B. 100 mm, 2,1 mm, ≤ 2 µm, Druck ≥ 700-800 bar) so gibt es Fälle, in denen man es lieber nicht machen sollte. Tut man es doch, so sind Probleme zwangsläufig vorprogrammiert. Welche Fälle wären das? Die Lösung Es gibt eine Reihe von Situationen, in denen Trennungen unter HPLC-Bedingungen sinnvoller als unter UHPLC-Bedingungen sind. Ich greife willkürlich vier Fälle…

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20. Mai 2014

Trennung von polaren Analyten in der RP-HPLC

By B Optimierung, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Peaks vor - oder nahe - der Totzeit, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Vorsäule

Der Fall Nehmen wir an, Ihre Peaks, die ab ca. der 3-fachen Totzeit eluieren (also ab einem Retentionsfaktor von k = 3, was genügend starke Wechselwirkungen bedeutet), werden ordentlich getrennt. Kopfzerbrechen bereiten Ihnen eher die polaren Komponenten, die direkt nach der Totzeit eluieren – ihre Trennung sei dürftig. Verständlicherweise möchten Sie ungerne gleich die gesamte Methode verändern. Was wäre nun zu tun? Die Lösung Für die Verbesserung der Trennung von polaren Komponenten in der RP-HPLC könnte man sich einen 3-Stufen-Plan mit zunehmendem Aufwand vorstellen: Einfache Maßnahmen – Manipulation (im positiven Sinne!) der Probelösung – Probelösung polarer machen, um eine „On…

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20. April 2014

Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen (2)

By Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Ca. 70-80% der RP-Trennungen in der Routine sind Gradientenläufe. Den meisten Anwendern sind die Vorteile der Gradientelution geläufig, so z. B: Trennung von polaren und apolaren Komponenten in einem Lauf, merklich kürzere Trenndauer im Vergleich zu isokratischen Läufen, Erniedrigung der Bestimmungsgrenze und nicht zuletzt: Ein Übersichtsgradient ist ein hervorragender erster Schritt bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe. Was ist nun bei Gradiententrennungen grundsätzlich „anders“ im Vergleich zu isokratischen Trennungen? Die Lösung Isokratische und Gradiententrennungen stellen zwar keine gänzlich andere Welten dar, gibt es doch einige entscheidende Unterschiede. Nachfolgend greife ich stellvertretend zwei Unterschiede heraus. Interessierten Lesern sei auf…

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20. März 2014

Ungewöhnlich aber erfolgreich…

By B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, polare Komponenten

Der Fall Zwischen den Jahren habe ich einen Nebenraum meines Büros aufgeräumt. Wie oft in solchen Fällen fand ich manches Interessante, u. a. auch längst vergessene Messungen. Beim Durchblättern der verstaubten Ordner ist mit folgendes abermals bewusst geworden: Früher hat man auch ungewöhnliche Sachen einfach ausprobiert – auch als „normale(r)“ Anwender(in), nicht nur als forschender Mensch. Die Angst des Scheiterns war früher nicht so stark wie heute, von der zur Verfügung stehenden Zeit gar nicht zu sprechen… Ich gebe Ihnen nachfolgend vier Beispiele. Die Lösung 1. Ionen werden üblicherweise an schwache Ionenaustauscher getrennt, die IC ist seit längerem eine gut…

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20. Januar 2014