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Ist die vorliegende Methode eine robuste Methode?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Robustheit

Der Fall Die Kollegen aus der Entwicklung schicken Ihnen eine Methode oder der Chef kommt triumphierend in das Labor mit der Kopie einer Methode in der Hand und sagt: „Machen Sie mal.“ Oder Sie bekommen den neuesten Prospekt der Firma Fanta­siechrom GmbH mit der Abbildung eines Chromatogramms samt Methode, die Sie gut gebrauchen können. Bevor Sie irgend etwas Chromatographisches anfangen, wür­de ich Ihnen dringend empfehlen, die Methode bei einer Tasse Kaffee/Tee etwas genauer anse­hen. Die Lösung Bei einigen Methoden weiß man/frau von Anfang an, dass sie kaum robust sein können. Wenn Sie dennoch die Methode übernehmen müssen, sollten Sie wenigstens…

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Wie wähle ich meine HPLC-Anlage bzw. meinen HPLC-Lieferanten aus?

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps

Der Fall Vielleicht haben Sie demnächst beim Kauf einer Anlage zu entscheiden, welches Ge­rät gekauft wird, oder Sie sollen für den Chef die Entscheidung vorbereiten. Auch für erfahrene Anwender kann dies bei der aktuellen Anzahl von Herstellern und Gerätetypen zu einem großen Problem werden. Welche Fragen sollten Sie im Vorfeld für sich abklären? Die Lösung Wir gehen in dem konkreten Fall davon aus, dass die Entscheidung für die HPLC als die geeignete Methode für Ihr Trennproblem richtig ist – nicht immer eine triviale Entscheidung. Man sollte bei dem Kauf sowohl Kriterien allgemeiner Natur als auch wissenschaftlich-technische Forderungen berücksichtigen. Zu den…

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Wie kritisch sind Temperaturschwankungen/Temperaturveränderungen? Teil II: Säule, Trennung

By Auflösung, B Optimierung, Bodenzahl, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Optimierung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Durch eine Änderung der Trenntemperatur ändern sich die chromatographischen Grö­ßen sowohl in physikalischer (Δ Viskosität => Δ Kinetik => Δ Effizienz) als auch in chemischer/thermodynamischer Hinsicht: Δ Sorptionsenthalpie => Δ Retentionszeit => Δ Selektivität. Somit ist die Temperatur ein chromatographischer Parameter, mit dem die Trennung gezielt verändert werden kann. Wie ist nun der Parameter „Tem­peratur“ konkret zur Trennungsoptimierung einzusetzen? Die Lösung Eine Temperaturerhöhung bewirkt folgendes: Chemie Die Retentionszeit nimmt stets ab (einige chirale Trennungen stellen seltene Ausnahmen dar). Diese Abnahme verläuft für unterschiedliche Substanzen ungleich­mäßig. Somit haben wir eine Änderung der Selektivität. Diese ist z. B. stark ausge­prägt…

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Wie kritisch sind Temperaturschwankungen/Temperatureränderungen? Teil I: Allgemeines, Detektor

By A Fehlersuche, HPLC-Tipps, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Teil I: Allgemeines, Detektor Der Fall Die Temperatur hat eine direkte Einwirkung auf das chromatographische Ergebnis, da sie … die Wechselwirkung Probe ↔ stationäre Phase, die Viskosität des Eluenten und das Auflösen des Kieselgels … beeinflusst. Ferner kann sich bei erhöhter Temperatur manche Substanz zersetzen. Schließlich machen sich Temperaturschwankungen in der Detektorzelle im Chromatogramm von sehr stark (elektrochemischer Detektor) bis „nur“ ärgerlich (UV-Detektor) bemerkbar. Schauen wir uns hier das Problem eher allgemein von seiner technischen Seite her an. In diesem HPLC-Tipp wird uns der Komplex „Temperatur-Trennung“ beschäftigen. Die Lösung Ohne „Wenn und Aber“ gilt folgendes: Eine konstante Temperatur erhöht die Robust­heit…

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Maximal zulässiges Injektionsvolumen ?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung

Der Fall Durch die Art der Probenvorbereitung erhalten Sie eine stark verdünnte Probelösung oder Sie haben mit der Nachweisgrenze zu kämpfen, jedenfalls würden Sie gerne aus bestimmten Gründen ein relativ großes Probevolumen direkt injizieren. Wie groß darf dieses Volumen sein, ohne dass Sie sich dadurch eine merkliche Peakverbreiterung einhandeln? Wir setzen voraus, dass die Säule nicht überladen ist; hier ist also die Rede von einer evtl. Peakverbreiterung nur aufgrund der Injektion. Die Lösung Man kann über die Varianten der einzelnen Beiträge zur Peakverbreiterung das zuläs­sige Injektionsvolumen ausrechnen. Das ist möglich, da wir in der HPLC stochastisch unabhängige Prozesse haben. Nur…

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Injektion von Substanzen aus wäßrigen Lösungen

By A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung der Peakfläche

Der Fall Angenommen, Sie arbeiten mit Wasser als Probelösungsmittel. Wenn Sie bei konstant injizierter Probemenge unterschiedliche Peakflächen erhalten sollten, könnte dies an der teilweise irreversiblen Sorption Ihrer Substanz an einer „rauhen“ Oberfläche im HPLC-System liegen. Die Lösung Die irreversible Sorption vor allem von höhermolekularen Substanzen (z. B. Polyzuckern, Proteinen) an Stahl- oder Glasoberflächen oder am Dichtungsmaterial ist ein bekanntes Problem. Wenn die Probe in reinem Wasser aufgelöst ist, können derartige Oberflächen sich wie schwache stationäre Phasen (apolare Pseudophasen) verhalten, an denen eine geringe Menge der Probe sorbiert wird (Physisorption, Adhäsion). Sie kann ihrerseits nun bis zur Erschöpfung ihrer Kapazität weiteres…

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Wie teste ich eine HPLC-Anlage und auch die einzelnen Mo­dule?

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen

Der Fall Eine elementare Voraussetzung für eine richtige und präzise Analytik ist eine gut funktionierende Meßapparatur. Die einfachste und sicherste Methode zu deren Überprüfung ist die zweifache Injek­tion einer bekannten Probe, Standard- oder Kontrollprobe. Sind die erhaltenen Chromatogramme identisch mit einem Chromatogramm, das Sie bei einem einwandfreien Zustand der Anlage, z. B. nach einer Wartung, erhalten haben, bedarf es ei­gentlich keiner weiteren Überprüfung. Als Vergleichskriterien eignen sich: Retentionszeit, Peakfläche und -höhe, Asymmetriefaktor. Abweichungen, die noch zu ak­zeptieren sind, sind genau festzulegen. Gibt es solche, muss der aktuelle Zustand der HPLC-Module überprüft werden. Wel­che Tests eigenen sich dafür? Die Lösung Tab….

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Arbeitet die Pumpe richtig, präzise oder genau?

By C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Fluss, HPLC-Tipps, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Hier geht es nicht um Haarspalterei und diese Frage ist auch nicht als netter „Gag“ gedacht. Erst das Wissen um Genauigkeit, Richtigkeit und vor allem um Präzision einer Pumpe gibt Gewißheit über die Aussagekraft eines quantitativen Ergebnisses. Was bedeutet nun präzise und richtig in diesem Zusammenhang und wie werden diese Kenndaten ermittelt? Die Lösung Die Kenndaten werden durch einen Test bestimmt. Der Pumpentest besteht aus zwei Teilen. Pumpenrichtigkeit Mittels einer Stoppuhr und eines Meßzylinders/Meßkolben wird die Richtigkeit der Volumen­förderung überprüft (Messung am besten nach der Säule): Die Frage ist, fördert die Pumpe z. B. die gewünschten l ml/min…

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Übernahme einer Gradientenmethode – der Einfluss der Appa­ratur

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Ein klassischer Fall: Sie übernehmen eine Gradientenmethode und, obwohl Sie pein­lichst auf Einhaltung aller chromatographischen Bedingungen achten, erhalten Sie mit Ihrer Anlage ein anderes Chromatogramm. Warum? Die Lösung Fast immer liegt der Grund in den unterschiedlichen Verweilvolumina (Verzögerungs­volumina, Delay Volume oder Dwell Volume) einmal Ihrer Anlage und zum anderen der Anlage, mit der die Methode entwickelt wurde. Als Verweilvolumen wird das Volumen vom Ort der Mischung der zwei Eluenten (Mischventil, Mischkammer, T-Stück) bis zur Säule be­zeichnet. Dieses kann je nach Hersteller von ein paar hundert Mikrolitern bis zu mehreren ml betragen! Die Hochdruckgradienten haben im Vergleich zu den…

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Was sagt mir das Totvolumen einer isokratischen Anlage?

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Sicherlich haben Sie vom Totvolumen („extra column volume“) einer HPLC-Anlage gehört. Wenn Sie zu den AnwenderInnen gehören, die dieses gemessen und es ,,im Griff“ haben, brauchen Sie nicht weiter zu lesen, gehen Sie einfach zu einem nächsten HPLC-Tipp. Dieser HPLC-Tipp wendet sich an Leser, die der Meinung sind, dass nur TheoretikerInnen und ,,Supergenaue“ sich dafür interessieren sollten. Sie selbst möchten nur eine gute Trennung und haben für solche Spielchen keine Zeit. Ich stimme mit Ihnen völlig überein. Das was zählt, ist in der Tat die Trennung. Doch das Totvolumen beeinflusst sie, bei früh eluierenden Peaks und im isokratischen…

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