- Optimale Zeitpunkt für die Elution der wichtigsten/kritischen Peaks
- Lagerung in MeOH/ACN
- Isokratische Stufe beim Gradienten im Fall von kurzen Säulen
„Optimale“ Elution – wann sollen meine wichtigsten Peaks eluieren?
Zunächst direkt die Aussage: Die optimale Elution für die interessierenden Peaks liegt nach ca. der drei bis fünffachen Totzeit („Front“, Injektionspeak). Sehen Sie zu, dass – wenn irgendwie möglich – wichtige/kritische Peaks bei einem Retentionsfaktor, k (k: Maß für die Stärke der Wechselwirkungen), von etwa drei bis fünf eluieren, d.h. eben nach der drei bis fünffachen Totzeit. Warum? Hier drei Gründe:
1. Ab hier etwa fängt der robuste Bereich an. Die Konsequenz: Konstante Retentionszeiten in der Routine; kleine ungewollte Veränderungen beim Eluenten oder bei der Temperatur wirken sich kaum aus
2. Dieser Bereich entspricht einem optimalen Bereich der Wechselwirkungen. Die Konsequenz: Optimaler Beitrag von k sorgt für eine gute Auflösung
3. In diesem Bereich ergibt sich eine gute Effizienz (gute Bodenzahl). Die Konsequenz: Keine übermäßige und damit störende Peakverbreiterung
In Methanol/Wasser gelagerte Säulen
Für längere Zeiträume (mehrere Wochen/Monate) eignen sich zur Lagerung von polaren RP-Phasen eher ACN/H2O- (mehr als ca. 60 % ACN) als MeOH/H2O-Gemische. Begründung: In einem ACN/H2O-Gemisch ist die Gefahr der Abspaltung durch Hydrolyse von kleinen, polaren funktionellen Gruppen, z. B. C8, C4, Diol, CN, PFP, Phenyl-Hexyl usw. – also das bekannte „Bluten“ der Säule – nahezu unerheblich. 100% Methanol dürfte dagegen unkritisch sein. Soweit, so gut. Nun, einige Hersteller liefern ihre Säulen in MeOH/H2O. Was kann jetzt passieren? Sie arbeiten mit einer recht polaren RP-Säule und die Trennung funktioniert bestens. Sie bestellen beim gleichen Hersteller erneut die gleiche Säule, mit dem Herstellerhinweis, dass es sich um die gleiche Charge wie bei der ersten Säule handelt, dennoch sieht Ihr Chromatogramm „scheußlich“ aus. Es mag sein, dass es sich um die gleiche Säulen-Charge handelt. Die zweite jedoch war beim Hersteller eventuell längere Zeit gelagert. Ein Teil der polaren funktionellen Gruppen, siehe weiter oben, ist womöglich abgespalten und man erhält im Fall von basischen Komponenten beispielsweise stark tailende Peaks, denn: Jene interagieren nun mit frei gewordenen aktiven Silanolgruppen.
„Gleiche“ Charge ist nicht für jeden dasselbe…
Es ist zweifelsohne sinnvoll, im Rahmen der Methodenentwicklung oder später bei der Validierung drei Säulenchargen auszutesten. Hier ist Vorsicht geboten: Wenn Sie beim Hersteller drei Säulen aus drei „verschiedenen Chargen“ bestellen, bekommen Sie meist tatsächlich drei Säulen aus drei unterschiedlichen Herstellungsschargen. Für manchen Hersteller jedoch bedeutet „unterschiedliche Chargen“, dass die Säulen zu unterschiedlichen Zeitpunkten gepackt worden sind, sie sind jedoch aus der gleichen Herstellungscharge…
Denke an MeOH bzw. MeOH/ACN-Gemische
Wasser aus dem Eluenten wird an der Oberfläche von polaren, stationären Phasen adsorbiert. Bei der Trennung von polaren Komponenten wirkt sich dies positiv aus. Als organisches Lösungsmittel eignet sich bei Trennungen von polaren Komponenten tendenziell eher Methanol als Acetonitril. Erwarten Sie nicht ausschließlich stark polare Komponenten sondern auch moderat-polare und evtl. auch neutrale (apolare) Komponenten? Für diesen Fall folgender Vorschlag: Wenn Sie Ihren Gradienten beispielsweise mit 20% B starten und auf 80% B hochfahren möchten, könnten Sie mit 10% MeOH/10% ACN starten und dann auf 40% MeOH/40% ACN hochfahren: Sie nutzen in diesem Fall die gute polare Selektivität durch das Methanol und die gute Peakform durch das ACN (geringe Viskosiität, scharfe Peaks). Generell gilt: Eine ternäre Mischung, also Wasser bzw. Puffer-ACN-MeOH, erweist sich bei einer großen Polaritäts-Bandbreite der Komponenten in der Probe oft als vorteilhaft. Dies gilt auch und gerade bei isokratischen Trennungen.
Großes Verweilvolumen und kleines Säulenvolumen…
Ein großes Verweilvolumen („Dwell“- oder „Delay-Volume“) bei einer Gradientenanlage bedeutet, dass zu Beginn des Gradienten eine isokratische Stufe vorgeschaltet ist. Eine solche mag mitunter etwas Positives bewirken: Manche Peaks am Chromatogramm-Anfang werden besser abgetrennt, als wenn der Gradient „sofort“ an der Säule wäre und dort direkt wirkte. Bei einer kurzen Säule jedoch „sieht“ der Gradient im Fall eines längeren isokratischen Schrittes am Anfang nur einen Teil der Säule, d.h. es werden im schlimmsten Fall nur 50% der Säulenlänge ausgenutzt. Die Peaks werden nach hinten „gestaucht“, bei mehr als 10-15 Peaks werden die letzten Peaks evtl. schlecht abgetrennt.
