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Peakverbreiterung

Totzeit, Totvolumen, Verweilvolumen

Von Apparatur, Auflösung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Peakverbreiterung, Totvolumen, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Wir haben uns bereits über die Bedeutung dieser Begriffe sowie deren Einfluss auf die Trennung unterhalten, nur: In meinen Seminaren stelle ich häufig fest, dass diese Größen uneinheitlich, teilweise auch falsch benutzt werden. Auch ihr Einfluss auf die Trennung wird unter- oder überschätzt. Lasst uns diese Dinge noch einmal definieren, die „alten“ Leser mögen diese Wiederholung mir nachsehen. Die Lösung Vorbemerkung Aus praktischer Sicht gilt natürlich folgendes: Wenn diese Begriffe anders als hier definiert, benutzt werden und alle Beteiligte das gleiche darunter verstehen, gibt es selbstverständlich absolut keinen Handlungsbedarf. Nun zu den Definitionen: Totzeit oder Mobilzeit („dead time“,…

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24. November 2013

Der Einfluss des Probelösungsmittels auf das Chromatogramm

Von A Fehlersuche, Doppelpeaks, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Peakverbreiterung, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), Probenlösungsmittel, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Ist die Probelösung nicht identisch mit der mobilen Phase (bzw. mit der Anfangszusammensetzung vom Eluent A bei der Gradientelution) kann dies einen Einfluss auf das Chromatogramm haben. Wie macht sich das nun genau bemerkbar? Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: „Andere“ Probelösung kann vielerlei bedeuten: Andere Zusammensetzung, anderes organisches Lösungsmittel, anderer pH-Wert, andere Pufferstärke/anderes Salz etc. Konzentrieren wir uns auf die RP-Chromatographie und betrachten folgende drei Fälle: Die Probelösung kann polarer, apolarer oder einfach „anders“ als der (Anfangs-)Eluent sein. 1. Polarer – also im Sinne der RP-Chromatographie schwächer Diese Situation sollte stets angestrebt werden, denn: Wenn…

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24. Oktober 2013

„Trennleistung“, „Effizienz“, „Bandenverbreiterung“ das alles bedeutet doch fast das gleiche – oder?

Von Apparatur, Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Peakverbreiterung, Totvolumen

Der Fall Betrachten wir folgende drei Säulen: 250 mm 5 µm, 150 mm 3 µm und 75 mm 1,5 µm. Mit Hilfe der empirischen Formel: Bodenzahl = 3.000 x Länge der Säule in cm durch Teilchengröße in µm stellen wir leicht fest, dass alle drei Säulen – vorausgesetzt sie sind gleich gut gepackt – die gleiche Bodenzahl, nämlich 3.000 x 5 = 15.000 Böden liefern. Sind nun die Säulen wirklich vergleichbar, kann ich also bei gleicher Bodenzahl (15.000 Böden) und völlig identischen chromatographischen und apparativen Bedingungen die gleiche Trennung, sprich die gleiche Auflösung erwarten? Bemerkung: Vorteile der kürzeren Säulen wie…

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29. Mai 2009

In wie weit beeinflusst die Probelösung die Auflösung?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Im diesem Tipp haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probelösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit auch auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probelösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Hier möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probelösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probelösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer…

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29. Januar 2009

Nimm Dir die Zeit und lasse Chromatogramme „sprechen“…

Von A Fehlersuche, Auflösung, Bodenzahl, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Die Chromatogramme „erzählen“ viel – man sollte sich nur die Zeit nehmen, sie etwas bewusst anzuschauen. Das sei nachfolgend anhand der Chromatogramme der Abbildung 1 demonstriert. Dieses Beispiel stammt von der Arbeitsgruppe Prof. Engelhardt, Saarbrücken. Das obere Chromatogramm wurde mit einer neuen Säule aufgenommen, das zweite nachdem die Säule ein Jahr lang in Methanol/Wasser gelagert wurde. Was fällt auf und wie können wir die Unterschiede erklären? Abb. 1 Die zwei Chromatogramme wurden mit einem Abstand von ca. ein Jahr bei identischen chromatographischen Bedingungen aufgenommen, die Säule war in dieser Zeit in Methanol/Wasser gelagert Die Lösung Es fallen direkt…

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7. April 2008

Wieso ist der pH-Wert so wichtig, was bewirkt er eigentlich?

Von C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Alle diejenigen, die mit polaren/ionischen bzw. ionisierbaren Analyten zu tun haben wissen, dass der pH-Wert des Eluenten ein sehr wichtiger Faktor ist. Was bewirkt er jetzt genau? Hinweis 1: Mit diesem Thema kann man mindestens ein Tagesseminar bzw. einen 10-seitigen Artikel problemlos füllen. Nachfolgend werden nur einige wenige, grundsätzliche Dinge angesprochen. Hinweis 2: Wir beschränken uns auf die RP-HPLC; bei der Ionenaustausch- und Ionenchromatographie herrschen klare, „geordnete“ Verhältnisse, es gibt wenige Probleme, da in der Regel nur ein Mechanismus, eben Ionenaustausch vorliegt. Die Lösung Der pH-Wert beeinflusst den Dissoziationszustand von sauren/alkalischen Komponenten sowie der freien Silanolgruppen (Rest-Silanolgruppen) an…

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7. Juli 2003

Die Sicht der Dinge… Oder: Selektivität vs. Peaksymmetrie von basischen Komponenten an hydrophoben Phasen

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Optimierung, Peakverbreiterung, polare Komponenten, Säulenauswahl

Nach Durchsicht meiner Notizen habe ich mich für folgendes Beispiel entschieden: Der Fall Habt ihr vor, stark basische Substanzen zu trennen? So, so, dann aber Vorsicht: Nehmt dazu von mir aus eure geliebten, modernen, teueren, sauberen, Metallionen-armen, gut abgedeckten, super endcappten Phasen. In einer Hinsicht habt ihr Recht: Ihr bekommt sicherlich schöne, symmetrische, schlanke Peaks –eine „scharfe“ Trennung eben, siehe Abb. 1. Abb.1 „Trennung“ von Pyridin/Benzylamin, Uracil (inert!), Phenol in einem sauren Phosphatpuffer an einer hydrophoben RP-Phase Seht ihr aber auch alles? Merke: Mit polaren/ionischen Komponenten und hydrophoben Phasen ist Umsicht eine unabdingbare Tugend. Die Lösung Tut mir und euch…

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5. Dezember 2002

Schnelle Optimierung einer bestehenden Gradientenmethode

Von B Optimierung, Gradient, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall Ich war einmal in einem befreundeten Unternehmen, in dem routinemäßig viele Gradientenmethoden laufen. Nicht alle waren aus Anwendersicht als zufriedenstellend zu bezeichnen. Wir wollten nun schauen, ob eine der häufig eingesetzten Methoden mit einem vertretbaren Aufwand verbessert werden könne, zumal die Anzahl der Proben sehr groß war. Der Versuch war erfolgreich. Ich möchte Ihnen nachfolgend zeigen, wie wir es bewerkstelligt haben, vielleicht können Sie davon profitieren. Die Lösung Abb. 1 stellt die Ausgangssituation dar: „Üblicher“ Methanol/Wasser-Gradient bei 1 ml/min, das Chromatogramm dauerte ohne Spülschritt ca. 16 min. Das war uns für zwei Peaks viel zu lang. Wir haben…

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8. Oktober 2002

Änderung nur der Peakhöhe bzw. nur der Peakfläche – die Ursachen

Von A Fehlersuche, Fluss, HPLC-Tipps, Peakverbreiterung, pH-Wert des Eluenten, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Für den Fall, dass auf ein Mal sowohl die Peakhöhe als auch die Peakfläche sich ändern gibt es eine Reihe von Ursachen, die jeder(m) erfahrenen Kollegin(en) sicherlich geläufig sind: verändertes Injektionsvolumen, instabile Probe, Leckage nach dem Injektor, evtl. Änderung vom pH-Wert (siehe diesen HPLC-Tipp), irreversible Sorption an „hungrigen Oberflächen“ (siehe diesen HPLC-Tipp), Änderung der Wellenlänge. Was bedeutet es aber, wenn nur die Peakhöhe bei konstanter Peakfläche bzw. die Peakfläche bei konstanter Peakhöhe sich ändert? Setzen wir voraus, dass Sie bewusst keine Hardware-Änderung vorgenommen haben, z. B. eine längere Säule oder eine Säule mit kleineren Teilchen eingesetzt. Vorbemerkung: Hier…

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10. Juli 2001

Miniaturisierung ja – aber was ist in der Routine wirklich machbar und sinnvoll?

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Optimierung, Peakverbreiterung, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Miniaturisierung ist aus wirtschaftlichen und analytischen Gründen häufig ein vernünftiger Ansatz. Was ist nun mit einem „normalen“ Gerät machbar und wann lohnt es sich? Die Lösung Vorbemerkung Für folgende Fälle kann ich die Skepsis mancher Kollegen gegenüber Miniaturisierung nachvollziehen und teilweise sogar teilen: Stark regulierte Umgebung, matrixbelastete Proben und/oder große Anzahl an Komponenten, keine HPLC-Spezialisten in Routine-/Betriebslabors, knappe Zeit, um auftretenden Fehlern nachzugehen, usw.. Das bedeutet keinesfalls, dass in solchen Fällen Miniaturisierung nicht sinnvoll ist, es heißt nur, dass vor einer „Ja/Nein“-Entscheidung eine nüchterne Analyse mit objektiven und belegbaren Vor-/Nachteilen unabdingbar ist, z. B: Was gewinne ich an…

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14. Dezember 1999