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Veränderung des Chromatogramms

Unterschiede zwischen isokratischen und Gradiententrennungen (1)

Von Auflösung, Bodenzahl, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lebensdauer der Säule, Lösungsmittel, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Wir wissen alle, was der Unterschied zwischen isokratischen und Gradientrennungen ist: Bei isokratischen Trennungen bleibt die Zusammensetzung des Eluenten während der Gesamttrennung konstant, bei Gradiententrennungen erhöht sich permanent die Elutionsstärke; so nimmt beispielsweise bei RP-Trennungen vom Anfang bis Ende des Laufs der MeOH- bzw. ACN-Anteil der mobilen Phase zu – die Wechselwirkungen zwischen Eluent und stationärer Phase nehmen ebenfalls zu – und die Peaks werden nach vorne „geschoben“. So weit so gut. Wo liegen nun aus praktischer Sicht die Unterschiede zwischen beiden Trennmodi? Die Lösung Der Unterschiede gibt es zu Genüge, nachfolgend die Wichtigsten inkl. kurzer Kommentierung: Peakform…

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25. Mai 2012

Eine Differenz von 0,1-0,5% im Lösungsmittel – wie kritisch ist es?

Von A Fehlersuche, ACN, Behältnisse, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Probenlösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Als erfahrene(r) HPLC-Anwender(in) weiß man/frau, dass die präzise Herstellung von Eluent und Probelösung eine elementare Grundvoraussetzung für reproduzierbare Ergebnisse ist. Soweit so gut. Jetzt ist die Frage, wie stark machen sich denn kleine ungewollte/unbeachtete Differenzen wirklich bemerkbar? Die Lösung Sie können in der Tat sehr viel bewirken! Fangen wir bei der Herstellung des Eluenten an und betrachten zunächst die Normal-Phasen-Chromatographie. Hier ist der Einfluss am stärksten. So kann es viel ausmachen, ob beispielsweise ein NP-Eluent (z. B. Hexan) abhängig von den Aufbewahrungsbedingungen der Lösungsmittel und der Praxis des Ansetzens 30 oder 60 ppm Wasser enthält, denn: Eine konstante,…

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26. November 2011

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Probengeber, Uncategorized, Veränderung des Chromatogramms

Die lieben Amerikaner… Der „liebe“ Autosampler… Amerikaner sind „anders“. Ich liebe ihre offene, unkomplizierte Art. Denk- und Handlungsweise sind eher leicht nachvollziehbar, jene rational zu belegen für Europäer und andere nicht immer einfach. Wie auch immer, Manches ist nun so wie es ist, man muss es nur wissen. Es gilt die Konsequenzen zu ziehen und Vorsicht walten zu lassen. Wir sind bei den „Kleinen“, deswegen beschränke ich mich hier auf einige mögliche Missverständnisse und Fallstricke in äußerst knapper Form. Ich habe solche gewählt, die sowohl die analytische Praxis als auch das analytische Verständnis im Allgemeinen adressieren: Was heißt „0,5 %“?…

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26. Juli 2011

Sind ein kleines „Delay Volume“ der Apparatur und/oder ein kleines Volumen der Mischkammer immer „gut“? oder: Was ein Paar „Mikroliterchen“ alles bewirken können…

Von A Fehlersuche, Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Veränderung des Chromatogramms, Verweilvolumen

Der Fall Im Zuge der Verbreitung von UHPLC-Geräten warten die Hersteller mit immer kleineren Verweilvolumina (Verweilvolumen, auch: Verzögerungsvolumen, „Delay Volume“, „Dwell Volume“, das ist das Volumen von der Mischkammer bis zur Säule) bzw. Volumina der Mischkammer (35 – ca. 60 µl) auf. Da ist zunächst nichts dagegen einzuwenden. Kleine Volumina können jedoch auch Nachteile mit sich bringen. Dabei denke ich im Moment nicht an eine erhöhte Gefahr für Niederschläge im Falle von starken Puffern. Und auch nicht an eine schlechte Mischungsqualität imfalle von großen Unterschieden in der Viskosität der zu mischenden Lösungsmittel in Kombination mit einem kleinen Volumen der Mischkammer….

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26. November 2010

Unterschiede in den HPLC-Anlagen – die Peakfläche

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, Fluss, HPLC-Tipps, Methodentransfer, Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Dass Geräte von unterschiedlichen Herstellern große Unterschiede aufweisen können, ist eine HPLC-Binsenweisheit. Der Unterschied kann im Verweilvolumen bei Gradientenanlagen liegen (Hochdruck vs. Niederdruck), in der Richtigkeit bei der Wellenlängeneinstellung (z. B. +/- 2 nm vs. +/- 4 nm), im Material der Nadel im Probengeber (z. B. Stahl vs. Keramik) und damit verbunden evtl. Memoryeffekte, in der unterschiedlichen Geometrie der Mischkammer oder der Detektorzelle bei u. U. identischem Volumen und, und…Diese Unterschiede sowie die Folgen sind erfahrenen AnwenderInnen bekannt: Unterschiede in der Retentionszeit, in der Peakfläche und in der Peakform. Im hiesigen Peak möchte ich gerne auf zwei Sachen…

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26. Oktober 2010

Die „Kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, ACN, Chromatogramm, Eluent, HPLC-Tipps, Integration, Uncategorized, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Verschiebung der Retentionszeit (2) Im diesem Tipp haben wir uns mit der Verschiebung der Retentionszeit beschäftigt, die Ursachen lagen in einer Veränderung der stationären Phase im Sinne der „Chemie“. Hier werden wir uns Änderungen der mobilen Phase widmen. Auch in diesem HPLC-Tipp geht es um ungewollte Veränderungen, also um solche, die nicht vom Anwender bewusst vorgenommen wurden, z. B. Eluenten-Zusammensetzung oder pH-Wert verändert. Nachfolgend werden einige Gründe für eine veränderte Eluenten-Zusammensetzung genannt. Sie resultieren durch kleine, ungeachtete/unbedachte Variationen beim Ansetzen der mobilen Phase oder während der Trennung. Ein Eluent wird z. B. manchmal dadurch hergestellt, dass der Puffer und die…

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29. Juli 2009

Die „kleinen“ im Sommer

Von A Fehlersuche, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Uncategorized, Veränderung der Retentionszeit, Veränderung des Chromatogramms

Hier geht es um eine unerwartete Verschiebung der Retentionszeit, d.h. um eine, die ohne eine bewusste Veränderung seitens des Anwenders erfolgt ist, also: Es wurde keine längere/kürzere/dünnere Säule eingebaut oder die Flussrate geändert. Grundsätzlich liegt in einem solchen Fall eine Verschiebung der Retentionszeit an einer Änderung der Temperatur, der stationären Phase (d.h. „Chemie“ der Oberfläche) und des Eluenten. Ungewollte Temperaturänderung stellt ein eher seltenes Problem dar, deswegen werden wir uns hier zunächst mit der stationären und dann dort mit der mobilen Phase befassen. Veränderung der stationären Phase Bemerkung: Es geht hier um eine Veränderung im Sinne der „Chemie“, d.h. nicht…

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29. Juni 2009

In wie weit beeinflusst die Probelösung die Auflösung?

Von B Optimierung, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, Lösungsmittel, Optimierung, Peakverbreiterung, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Im diesem Tipp haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probelösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit auch auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probelösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Hier möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probelösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probelösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer…

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29. Januar 2009

Einfluss des Probelösungsmittels auf die Trennung

Von A Fehlersuche, B Optimierung, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Wir haben uns bereits über den Einfluss der Probelösung auf die Peakform und somit auf die Trennung unterhalten. So führt ein zu starkes Probelösungsmittel (Probe z. B. in mehr MeOH oder ACN im Vergleich zum Eluenten) zum Fronting oder gar zu Doppelpeaks, andererseits führt ein schwaches Probelösungsmittel – mehr Wasser im Vergleich zum Eluenten – zur Aufkonzentrierung am Säulenkopf und somit zu einer Verbesserung der Peakform. Die Folge lautet im zweiten Fall: Verbesserung der Auflösung bzw. Erniedrigung der Nachweisgrenze, vor allem bei früh eluierenden Peaks. In letzter Zeit haben wir uns intensiv mit der Injektion befasst und haben…

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7. Oktober 2008

Empfehlungen in Geräte-Handbüchern – seien Sie etwas vorsichtig!

Von B Optimierung, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Einstellparameter, HPLC-Tipps, Integration, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Handbücher von Gerätehersteller sind meist sehr nützlich – zwar manchmal viel zu umfangreich und von Softwarespezialisten statt von Analytikern verfasst, aber dennoch: Manches wird erst nach deren Lektüre wirklich klar. Trotzdem ist Vorsicht geboten: Einige Empfehlungen sind irreführend oder einfach falsch. Welche Beispiele könnte man diesbezüglich anführen ? Die Lösung Dergleichen gibt es einiges, hier möchte ich beispielhaft auf zwei Empfehlungen bzgl. Einstellparameter eingehen: 1. In manch einem Manual steht, dass ein Peak mit 20-25 Datenpunkten ausreichend darstellbar sei. Dies stimmt jedoch nicht für schnelle Peaks. Bei einer Peakbreite von z. B. 9 s im Falle eines schnell…

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7. September 2008