0
Kategorie

Allgemein

Die kleine Frage zur Validierung

Von Allgemein, Monatstipp, Variationskoeffizient (Vk), Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

„Wir erreichen den geforderten VK nicht. Der Kunde will aber nicht, dass wir an der Methode etwas ändern, was können wir tun?“

Antwort:
Einfach mehr Messwerte erzeugen; das klingt einfach, ist es auch, es funktioniert, ist oft das kleinste Übel und manchmal die beste und einzige Möglichkeit, „legal“ den VK (Variationskoeffizient/relative Standardabweichung, engl.: Relative Standard Deviation, RSD) „runterzudrücken“.
Erläuterung:
Die Standardabweichung ist ein Maß für die Präzision, je kleiner die relative Standardabweichung (RSD: Standardabweichung bezogen auf den Mittelwert), umso präziser die Methode. Wenn ich einen Wert erzeuge, ist die Standardabweichung 1, bei vier Werten ist sie 0,5 usw., siehe in der Abbildung die Abnahme der Standardabweichung mit der Anzahl der Messwerte.

Irgendwann lohnt sich der Aufwand allerdings nicht: Ob 20 oder 25 Messwerte – das macht beim VK kaum was aus. Aus der Abbildung wird ebenfalls ersichtlich, warum in der Analytik die Anzahl der Werte oft zwischen ca. 6 und 10 liegt: Das ist ein vernünftiger Kompromiss zwischen Aufwand und kleinem VK.
Wann sind ca. 10 Werte angebracht?
Im Falle einer komplexen Matrix (z. B. biologische Matrix, Lebensmittel-/Umwelt-Probe), da hier die Messwerte erfahrungsgemäß recht stark streuen. Oder auch wenn durch die Probenvorbereitung die Werte ebenfalls stark streuen können, z. B. Derivatisierung, Extraktion.
Wann sind ca. 6 Werte angebracht?
Im Falle einer einfachen Analytik und einer klaren, einfachen Probelösung, z. B. Wirkstoffanalytik in der Pharma.

Natürlich kann und wird auch vielfach der VK mit 3 Werten ermittelt. Die statistische Relevanz bleibt jedoch in solchen Fällen nicht gewahrt.

Weiterführende Infos zum Thema „Validierung“:

Artikel, Dokumente, Definitionen, Beratung, Bücher: https://www.kromidas.de/validierung/

Kurse:
Kompakter 1-tägiger Kurs „Das 1 x 1 der Validierung“ als firmeninterne Schulung (Online oder Präsenz) https://www.kromidas.de/das-1×1-der-validierung/

2-tägiger Intensivkurs „Chromatographische Methoden „richtig“ validieren“, als firmeninterne Schulung (Online oder Präsenz): https://www.kromidas.de/chromatographische-methoden-richtig-validieren/
Als offene Online-Schulung: https://seminare.provadis.de/seminare/seminar/2/700/31570

1. Oktober 2025

Die kleine Frage zur Validierung …

Von Allgemein, Einstellparameter, Jahrestipps, Nachweisgrenze

„Wir haben bei der Bestimmung vom LOQ starke Schwankungen. Auch an unterschiedlichen Geräten und mit neuen Säulen. Woran kann das liegen? Als LOQ-Kriterium haben wir wie üblich ein S/N-Verhältnis von 10:1.“ Antwort: Die Erfahrung zeigt, dass hier mit recht großen Integrationsfehlern zu rechnen ist. Wir konnten zeigen (s. Infos am Ende des Beitrages), dass kaum eine kommerzielle Software in der Lage ist, bei automatischer Integration und einem S/N-Verhältnis von 10:1 so zu integrieren, dass der Fehler – bei optimalen (!) Bedingungen (BL-Trennung, kaum Drift usw.) – nicht mindestens 5-10 % beträgt. Siehe dazu weiter unten die Werte in der Tabelle für den ersten, kleinen Peak (oben): In den grau schraffierten Feldern befinden sich Werte mit einer Abweichung von mehr als 1 % vom richtigen Wert, bedingt durch eine fehlerhafte Integration.   Einige Kommentare und Erläuterungen zu den Werten der Tabelle: Die verwendeten Einstellparameter („Settings“) wie Dwell-Time, Time Constant, Sample Rate usw. können – vor allem bei kleinen Peaks – die Integration beeinflussen. So ist beispielsweise die Abweichung vom richtigen Wert beim ersten Peak bei einem Threshold-Wert von 50 12,50 %, bei einem Threshold-Wert von 100 17,78 % (EZChrom) Bei einigen Software-Programmen können unterschiedliche Integrationsalgorithmen angewandt werden. Die erhaltenen Ergebnisse können…

Weiterlesen
1. September 2025

Die kleine Frage zur Validierung …

Von Allgemein, Jahrestipps, Nachweisgrenze

„Validierung ist aufwendig und teuer; was ist das Minimum an Validierung, was wir machen müssen?“ Zwei Vorbemerkungen Vor einer Antwort halten wir wie folgt fest: 1. Es gibt viele Definitionen zur Validierung, eine davon lautet: „Das Ziel bei der Validierung einer analytischen Methode ist zu zeigen, dass sie für den beabsichtigten Zweck geeignet ist.“ 2. Validierung ist – anders als z. B. GLP – kein Gesetz. Es gibt demnach de jure keine offizielle Stelle, die bzgl. Umfangs, Validierungstiefe, Durchführung, Revalidierungbedarfs etc. gesetzlich bindende Vorgaben macht. Somit jetzt schon einige Schlussfolgerungen: Validierung ist demnach etwas recht Individuelles: Um was geht es in einem aktuellen Fall eigentlich? Muss ich eher formale Sachen beachten, muss also eine wichtige Person/Organisation lediglich „nicken“? Oder stehen analytische Gesichtspunkte im Vordergrund, die notwendiger-/sinnvollerweise zu beachten sind? Sehr wohl ergibt sich häufig de facto aus bestimmten Zwängen/Gegebenheiten genau „was“, „wie“, und „wieviel“ an Validierung zu tun ist. Wenn ich diese Vorgaben missachte, bekomme ich beispielsweise keine Zulassung für mein Produkt bzw. kann ich besagte Methode gar nicht anwenden. Wenn ich solchen Zwängen nicht unterliege, kann ich selbst denken und dem „beabsichtigten Zweck“ gemäß handeln. Das heißt, ich suche aus der „Validierungsklaviatur“ (Richtigkeit, Präzision, Linearität, Robustheit etc.) diejenigen Validierungsparameter…

Weiterlesen
7. August 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Der orthogonale Test: Bester Test bzgl. Nutzen/Aufwand-Verhältnisses zur Prüfung der Peakhomogenität

Von ACN, Allgemein, Chromatogramm, Eluent, Jahrestipps, Lösungsmittel, Optimierung, Säule, Säulenauswahl, Stationäre Phase, Veränderung des Chromatogramms

Zusammenfassung: Orthogonaler Text: Verwende eine „ganz“ andere Säule (z. B. statt einer C18 nun eine PFP oder eine Mixed Mode) und/oder einen anderen Eluenten (mobile Phase statt mit ACN nun mit MeOH) und injiziere erneut. Ähnliche Substanzen gehen wahrscheinlich (etwas) andere Wechselwirkungen mit der stationären Phase ein. Somit offenbart sich, dass ein symmetrischer Peak evtl. doch nicht homogen ist. Der Fall In den letzten zwei HPLC-Tipps haben wir folgendes gesehen: Eine Änderung von Einstellparametern („Settings“) sowie „Manipulationen“ der Probelösung stellen schnelle Möglichkeiten dar, die Peakhomogenität zu prüfen. Heute geht es um den orthogonalen Test. Was ist das und was „bringt“ er? Die Lösung Am Ende einer Methodenentwicklung kommt häufig die Frage auf: „Habe ich alle Peaks trennen können, oder liegt womöglich irgendwo im Chromatogramm doch eine Koelution vor“? Jetzt kommt der orthogonale Test ins Spiel – die Idee dahinter: Man verwende eine völlig andere stationäre Phase oder einen anderen Eluenten und injiziert erneut. Es ist ziemlich unwahrscheinlich, dass zwei oder drei Komponenten bei Verwendung zweier gänzlich (!) unterschiedlichen Säulen bzw. Eluenten in beiden Fällen völlig gleich starke Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen. Wenn nun mit einem Eluenten an zwei unterschiedlichen Säulen oder mit zwei unterschiedlichen Eluenten an einer Säule…

Weiterlesen
22. Mai 2025

Ist dieser HPLC-Peak „sauber“? Schnell durchzuführende Tests zur Prüfung der Peakhomogenität – im Focus heute: Die Probelösung (Diluent).

Von Allgemein, B Optimierung, Injektionsvolumen, Jahrestipps, Lösungsmittel, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), polare Komponenten, Probenlösungsmittel

Der Fall Wie beim vorherigen HPLC-Tipp geht es auch heute um die Frage, ob ein Peak homogen ist oder womöglich doch eine Koelution vorliegt. Beim letzten Mal haben wir gesehen, dass eine Änderung der Einstellparameter („Settings“) durchaus hilfreich sein kann. Heute steht die Probelösung im Focus: Schnell durchzuführende „Manipulationen“ bzgl. Probelösung können ebenso helfen. Welche wären das? Die Lösung Verdünne die Probelösung oder injiziere weniger Wir alle überladen öfters als gedacht die „arme“ Säule. Ergebnis: Verschlechterung der Auflösung. Eine lokale Überladung der Säule macht sich vor allem am Anfang des Chromatogramms bemerkbar; dort eluieren in einem RP-System polare Komponenten, die zusätzliche polare Wechselwirkungen mit der Oberfläche der stationären Phase eingehen können („Dualer Mechanismus“). Die Devise lautet: Probelösung, also Diluent, einfach mit Wasser verdünnen oder vielleicht noch einfacher: Weniger injizieren. In Abbildung 1, rechts, wird die Injektion von 20 µl Acetophenon gezeigt: Der erste Peak ist eine Verunreinigung, der zweite die Hauptkomponente Acetophenon. Anschließend wurde lediglich Eluent injiziert, linkes Chromatogramm. D.h. hier wurde der Memory-Effekt ausgenutzt: Es befindet sich häufig ein kleiner Rest der Probe an der Nadel, der nicht immer 100% weggespült wird. Wie man leicht erkennt, ist die Verunreinigung sauber, Acetophenon dagegen nicht: Auch mit 20 µl kann eine…

Weiterlesen
7. April 2025

Kriterien bei Systemeignungstests (SST) in der HPLC

Von Allgemein, Bodenzahl, Systemeignungstest (SST), Variationskoeffizient (Vk)

Der Fall Pragmatismus hilft oft – auch in der HPLC: Wenn alle Beteiligte (Anwender:innen, Labormanagement, Kunde, Auditor/Inspektor) mit den vorgegebenen Kriterien resp. SST-Anforderungen (SST: System Suitability Tests, Systemeignungstests) zufrieden sind, besteht kein dringender Handlungsbedarf. Wenn allerdings häufig OOS-Situationen auftreten oder das Aufwand/Nutzen-Verhältnis aus praktischer Sicht nicht wirklich überzeugend erscheint, sollten – sofern es realistisch Sinn macht – die aktuellen Kriterien hinterfragt werden. Welche SST-Kriterien sind sinnvoll? Die Lösung Halten wir vereinfacht wie folgt fest: Bei einem SST geht es darum zu überprüfen, ob diese Methode „hier und jetzt“ an diesem Gerät nach vorgegebenen Kriterien funktioniert. Bemerkung: Die Frage, ob für einen SST eine Standard-Lösung oder eine „reale“ Probelösung – also eine Lösung, die bzgl. Konstitution, Konzentration, Matrix etc. den Proben entspricht, die gleich vermessen werden – verwendet werden soll, lassen wir hier außen vor. Nun, die HPLC ist eine Trenntechnik; die zwei Hauptziele sind i.d.R.: 1. Genügend gute Trennung inkl. Identifizierung und damit zusammenhängend eine gesicherte qualitative Information: „Ich sehe alle mich interessierende Analyten/Peaks“ 2. Gesicherte quantitative Information: „Wie reproduzierbar ist die Integration und demnach die Ermittlung der Peakfläche der mich interessierenden Peaks?“ Und: „Ist der Wert überhaupt richtig?“ In den meisten Fällen liegt der Focus auf beides: „Ich will…

Weiterlesen
20. August 2024

Wie lang soll ich eine HPLC-Säule equilibrieren?

Von Allgemein, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Säule, Spülen, Reinigen & Equilibrieren

Der Fall Vorbemerkung: Die Rede ist hier von RP-Phasen und von kleinen Molekülen, Biomoleküle ist eine ganz andere „Story“ ebenso wie Ionenaustauscher und HILIC … Als Faustregel gilt: 10-15 Säulenvolumina sollten reichen. Das Säulenvolumen kann in erster Näherung mit folgender empirischer Formel berechnet werden: Vs = tM x F/0,8 mit: Vs: Säulenvolumen in ml tM: Totzeit in min F:  Fluss in ml/min Für eine 125 x 4 mm Säule beispielsweise (Fluss 1 ml/ min, Totzeit 1 min, Säulenvolumen ca. 1,25 ml), würden somit ca. 15-20 ml ausreichen. Nun, wie „gut“ ist diese Faustregel? Die Lösung Weiter oben vorgestellte Faustregel ist gut anwendbar für MeOH/Wasser- und ACN/Wasser-Eluenten ohne Zusätze. Ferner für eher saubere Proben, also keine Umwelt- oder biologische Proben bzw. stark kontaminierten Proben. Jetzt kommen wir zu den „schwierigeren“ Fällen, also zu Fällen, bei denen diese Faustregel ungenügend ist: Das notwendige Volumen zum Equilibrieren ist hier größer: Ältere Säulen, d.h. welche auf Basis von Kieselgel der ersten Generation (z. B. LiChrospher, Spherisorb, Bondapak, Supelcosil) sowie generell polare RP-Säulen wie Phenyl, Cyano oder Pentafluorphenyl, ferner Mixed-Mode-Phasen Stationäre Phasen mit größer spezifischer Oberfläche, z. B. 350 oder 400 m2/g. Solche haben i.d.R. kleine Porendurchmesser. Anders formuliert: Eine stationäre Phase mit 60 oder 80 Å-Poren…

Weiterlesen
16. Mai 2024

Möglichst maximale Peakkapazität in der HPLC gewünscht? Mach´s lang, dünn, warm, evtl. auch langsam

Von Allgemein, Auflösung, B Optimierung, Chromatogramm, Optimierung

Der Fall Nehmen wir an, Sie haben recht viele, recht ähnliche Komponenten zu trennen. In einem solchen Fall ist eine ausreichende Selektivität – also unterschiedlich starke Wechselwirkungen der einzelnen Komponenten mit der stationären Phase – realistischerweise kaum erreichbar. Der einzige Ausweg lautet: Eine möglichst gute Peakkapazität, also maximal mögliche Anzahl Peaks pro Zeiteinheit. Wie ist dies zu erzielen? Die Lösung Es gibt mehrere Formeln für die Peakkapazität, die zwei einfachsten sind folgende: nC = tRl – tRf / w   und   nC = tG / w mit: nC: Peakkapazität tRl: Retentionszeit des letzten Peaks tRf: Retentionszeit des ersten Peaks tG: Gradientendauer w: Peakbreite Was heißt das nun? Vereinfacht folgendes: Ich brauche eine große Differenz zwischen der Retentionszeit des letzten und des ersten Peaks und die Peakbreite soll möglichst klein sein. Diese allgemeine Forderung ist „zeitlos“, gilt für alle Gradientenarten und ist auch unabhängig davon, ob es sich um kleine oder große (Bio)Moleküle handelt. D. h. sie ist anwendbar sowohl imfalle von RP-Trennungen als auch beispielsweise bei Ionenaustauschertrennungen von Oligonucleotiden mittels Salz- bzw. pH-Wert-Gradienten. Was braucht man also? * Einen langen Gradienten und einen hohen Fluss (großes Gradientenvolumen) * Eine lange, möglichst dünne Säule (große Retentionszeitdifferenz letzter/ertster Peak, maximal erreichbare Auflösung aufgrund…

Weiterlesen
4. April 2024

Eine passende Frage zu diesem Befund …

Von A Fehlersuche, Allgemein, B Optimierung, Eluent, Optimierung, pH-Wert des Eluenten

Liebe Leserinnen, liebe Leser, weiter unten finden Sie den jeweils ersten Teil der halben Sätze aus dem Dezember-Tipp, so dass nun die Befunde komplett sind: Ich weiß, dass … … sich der Fluss geändert hat (Leck, Luft in der Pumpe)… weil die Peakfläche, aber kaum die Peakhöhe sich geändert hat … das Probelösungsmittel organischer ist als der Eluent/der Anfangsgradient… weil die frühen Peaks mit einem starken Fronting eluieren … der pH-Wert des Eluenten sich geändert hat oder – seltener – funktionelle Gruppen auf der stationären Phase hydrolysiert worden und dadurch nun mehr Silanolgruppen vorhanden sind … weil nur einige Peaks tailen und auch später eluieren – restliche Peaks sind OK … dass ich eine recht hydrophobe, endcappte, „klassische“ C18 stationäre Phase habe… weil eine derartige RP-Phase sehr ähnliche Komponenten (z. B. Isomere) nicht trennen kann … dass ich in der Probe entweder sehr große Moleküle oder sehr kleine, ionisch vorliegende Substanzen habe… weil solche Komponenten vor der Totzeit eluieren (Peaks vom letzten Lauf, Kontaminationen im Eluenten, Luft usw. können ausgeschlossen werden) … dass das Totvolumen der Apparatur zu groß im Vergleich zu dem Säulenvolumen ist…weil dies die einzige Ursache sein kann, dass bei neutralen Komponenten die Peaksymmetrie mit zunehmender Retention…

Weiterlesen
29. Januar 2024

Trends in der HPLC

Von Allgemein, Detektor, Eluent, LC-MS-Kopplung, Optimierung

Trends in der HPLC Stavros Kromidas Vom 18.-22. Juni 2023 fand in Düsseldorf die HPLC2023 („International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques”), die wichtigste und größte Tagung auf dem Gebiet der HPLC, statt. Nachfolgend erfolgt ein kurzer Bericht über Trends und Highlights. Vorab jedoch ein Punkt, den ich mir selbst immer wieder bewusst machen muss: Auf solchen Tagungen werden naturgemäß zum großen Teil Ergebnisse und Projekte aus der Forschung vorgestellt. Dieses Bild der HPLC entspricht selbstverständlich nicht der Ist-Situation in „real-life“ Labors. Ob und wann besprochene Techniken das „normale“ HPLC-Labor auf breiter Basis erreichen, ist ungewiss. Highlight: Mehrdimensionale Trennungen Kaum ein Vortrag, ein Tutorial oder ein Poster in dem es nicht um „Multi“ ging: Im einfachsten Fall um Multidetektion, multimodale MS, 3-4 D-Chromatographie usw., also kurzum: Mehrdimensionale Kopplungstechniken. Begründung: Die Herausforderung in aktuell wichtigen Gebieten wie „omics“ (Metabolomics, Lipidomics, Proteomics, Metallomics), Forensik, Umweltanalytik, Spezialpolymeren, personalisierte Medizin etc. lautet: Erfassung von Metaboliten, Verunreinigungen, Zersetzungsprodukten, das sind beispielsweise vielfach Isobare/Isomere – und: Neben der „Trennung“ geht es um möglichst genaue Strukturinformationen, im optimalen Fall um evidenzbasierte Identifizierung. Und dies noch in einer unwahrscheinlich großen und unbekannten Zahl zudem in äußerst geringen Konzentrationen. Schließlich heißt das Ziel: Maximale Information…

Weiterlesen
5. Juli 2023