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Generische Gradienten in der RP-HPLC II

By B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel, Veränderung der Retentionszeit

Der Fall In diesem Tipp hatte ich Ihnen einige Faustregeln und Erfahrungswerte vorgestellt, mit deren Hilfe man eigene, der Fragestellung passend generische Gradienten entwickeln kann. Hier möchte ich Ihnen einige Beispiele zeigen, bei Bedarf folgt eine kurze Erläuterung. Diese Chromatogramme stammen im Wesentlichen aus umfangreichen Untersuchungen, die Hans-Joachim Kuss durchgeführt hat. Die Lösung Die ausgesuchten Beispiele befassen sich mit den Fragen „Start % B“ und „Steilheit“ Die oft angewandte Praxis, mit „viel“ Prozent Wasser/Puffer zu starten, ist selten zweckdienlich, denn: Ein Starten mit hohem wässrigen Anteil führt dazu, dass alle Peaks auf der stationären Phase quasi „festgehalten“ und im Chromatogramm…

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Generische Gradienten in der RP-HPLC I

By B Optimierung, Eluent, Gradient, HPLC-Tipps, Lösungsmittel

Der Fall Gradientelution ist den Königsweg bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe in der RP-HPLC. Ein Gradientenlauf ist ferner der erste – und mangels Zeit oft auch der einzige – Schritt, wenn es um eine schnelle Information geht, so beispielsweise bei der Reaktionskontrolle. Vielerorts haben sich nun sogenannte generische Gradienten etabliert: Ein generischer Gradient ist ein Gradient, der sich für meine, immer wieder zu analysierenden, recht ähnliche Substanzen und meine Zielsetzung als geeignet erwiesen hat. So ist beispielsweise „0,1-0,05% TFA/ACN“ für viele Fragenstellungen ein bewährter Gradient. Über solche Gradienten und Faustregeln, die sich in der Praxis als praktikabel erwiesen haben,…

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Die „Kleinen“ im Sommer

By A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, HPLC-Tipps, Probengeber, Uncategorized

Peakfläche und Injektion, Spülen von RP-Säulen Mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche (hier: Injektor) Weitgehend bekannte Ursachen wie Leckage, Luft in der Spritze, verstopftes Nadelloch durch Dichtungsmaterial/Septumpartikelchen/Salz etc. lassen wir heute außer Acht, ich würde gerne eher auf Sachen eingehen, an die man vielleicht nicht sofort denkt. Nachfolgend stichwortartig einige Ideen und Denkanstöße. Erstes großes Thema: Memory-Effekt durch Physisorption bestimmter Analyte an unterschiedlichen Oberflächen. Merke: Die Affinität gegenüber Oberflächen hängt nicht nur vom Material der Oberfläche selbst, sondern auch von den chromatographischen Bedingungen ab. Unterschiedliches Material der Kapillare (Peek vs. Stahl) Unterschiedliches Material der Nadel (Stahl vs. Messing vs. Titan vs. Peek vs. Keramik) auch…

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Die „Kleinen“ im Sommer

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Schauen wir uns die in diesem Tipp beschriebenen Fälle an: Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (II)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Peakfläche und konzentrationsabhängiger Detektor 1. Nehmen wir an, am Eingang zum Detektor tritt eine Leckage auf und ein Teil der Probe geht dadurch verloren. In…

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Die „kleinen“ im Sommer

By Apparatur, Auto-Sampler, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Detektor, Fluss, HPLC-Tipps, Injektionsvolumen, polare Komponenten, Probengeber, Uncategorized, Veränderung der Peakfläche, Veränderung der Retentionszeit

Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich (I)? Leckage am UV-Detektor – was stelle ich fest? Doppeltes Injektionsvolumen – doppelte Peakfläche? Flussänderung – bleibt die Peakfläche konstant? Mehr Wasser im Eluenten ; eluieren die Peaks später, und wenn ja, warum? Wieso eluiert eine starke Base an einer stark belegten C18-Phase später als eine neutrale Komponente? Mehr Acetonitril im Eluenten, die Peaks eluieren früher; wird die Trennung schlechter?  Betätigen wir uns gerade ein wenig „sportlich“ und betrachten nun folgende Situationen: Jeder von uns macht in seinem (HPLC-) Alltag mechanisch Handgriffe, die richtig und dienlich sind; auch werden erwartete Ergebnisse als selbstverständlich angesehen –…

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Das Totvolumen: Wie kritisch ist es wirklich? Und: Ist ein solches „schlimmer“ vor oder nach der Säule?

By Apparatur, C - Einführungen, Überblicke, Routine-Tipps, Wartung, allgemeine Hinweise, Gradient, HPLC-Tipps, Optimierung, Totvolumen

Der Fall Totvolumen ist das Volumen der Apparatur außerhalb der Säule in dem die Probe sich befindet; also, das Volumen vom Probengeber bis einschließlich Detektor – eben ohne Säule. Wir haben in unserer HPLC-Tipps-Reihe uns bereits mit dem Thema beschäftigt. Dennoch wird jenes insbesondere im Kontext mit Miniaturisierung und UHPLC weiterhin intensiv diskutiert, deswegen möchte ich es erneut aufgreifen. Wie wichtig, wie „schlimm“ ist das Totvolumen nun tatsächlich? Die Lösung Im aktuellen Tipp möchte ich wenig schreiben, dafür umso mehr Bilder zeigen. Merke direkt folgendes, was gleichzeitig bereits als Fazit der ganzen Diskussion gelten kann: Das Totvolumen ist wirklich wichtig…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (II)

By A Fehlersuche, Chromatogramm, Gradient, HPLC-Tipps, Methodenentwicklung, -Transfer und -Optimierung, Methodentransfer, pH-Wert der Probe (bzw. des Probenlösungsmittels), pH-Wert des Eluenten, polare Komponenten, Systemeignungstest (SST), Veränderung der Peakfläche, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall In diesem HPLC-Tipp haben wir uns darüber unterhalten, dass bestimmte Komponenten durch Adhäsion an vielen Oberflächen ganz oder teilweise irreversibel haften bleiben können. Deswegen sollte man im Falle des Falles auch an unwichtig anmutende Änderungen oder Unterschiede in den Abläufen und in den Utensilien von Labor zu Labor denken. Heute wollen wir schauen, welche, eher chemische Ursachen infrage kommen, wenn eben nur ein Peak (oder auch zwei) im Chromatogramm Probleme bereitet(en). Die Lösung Vorweg: Vermutlich ist der pH-Wert oder – genauer – seine Veränderung die wichtigste Ursache für das hier besprochene Problem und hier wiederum dürften folgende zwei…

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Warum macht nur ein Peak Probleme? (I)

By A Fehlersuche, Apparatur, Auto-Sampler, Chromatogramm, HPLC-Tipps, Probengeber, Veränderung des Chromatogramms

Der Fall Sie wenden eine Routinemethode an, alle Peaks im Chromatogramm verhalten sich wie von Ihnen erwartet: Die Retentionszeit bleibt konstant, die Peakfläche ebenso und die Peakform ist soweit OK. Nur ein (oder zwei) Peak(s) macht(en) Probleme, z. B: Nur dieser eine Peak ist breit und/oder seine Fläche ändert sich permanent und/oder evtl. ändert sich auch seine Retentionszeit. Was kann die Ursache sein? Die Lösung Wir beginnen mit dem, was nicht sein kann: Nachdem die übrigen Peaks sich „anständig“ verhalten, können wir alle Substanz-unspezifische Faktoren (die ja alle Peaks betreffen würden – mal stärker, mal schwächer, aber eben alle) ausschließen:…

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Peaky und Chromy – die „HPLC-Versteher“? (die Antworten)

By Apparatur, Auflösung, Detektor, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Vorsäule, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Herzlichen Glückwunsch an Dr. Marcus Hans! Marcus Hans hat die richtigen Antworten geliefert, seine kurzen Erklärungen sind sehr prägnant und werden nachfolgend nahezu wörtlich verwendet: Peaky meint: Das Totvolumen nach der Säule ist wichtiger als vor der Säule, ferner ist bei Gradiententrennungen das Totvolumen der Apparatur viel unwichtiger als das Verweilvolumen.Aussage ist korrekt; das Totvolumen nach der Säule ist viel wichtiger als jenes vor der Säule: So kann die Verbreiterung der Substanzbanden durch eine lange/dicke Kapillare, ein nicht richtig sitzendes Fitting oder ein großes Volumen der Messzelle die in der Säule erfolgte Trennung zunichte machen. Bei Gradiententrennungen dagegen ist das…

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Peaky und Chromy – die „HPLC-Versteher“? (die Fragestellungen)

By Apparatur, HPLC-Tipps, kleine Peaks, Totvolumen, UHPLC und Miniaturisierung, Vorsäule, Z - Sonstiges (Weihnachtsgeschichten, Peaky & Chromy, Kreuzworträtsel, ...)

Liebe Kolleginnen, liebe Kollegen möglicherweise fehlt auch Ihnen bei Diskussionsrunden schwer, Aussagen von Fachleuten zu beurteilen. Umso mehr, wenn sie sogar wahrhaftig erscheinen… Lasst uns nun zwei Fachleuten lauschen – sofern sie tatsächlich welche sind: Unseren Peaky und Chromy. Peaky fängt an – wie sollte es auch anders sein – aber Chromy will nicht zurückstecken und im Anschluss präsentiert auch er seine Aussagen. Wenn Sie möchten, überlegen Sie sich welche Aussagen richtig sind. Hier geht es zu den richtigen Antworten. Viel Erfolg! Peaky meint: Das Totvolumen nach der Säule ist wichtiger als vor der Säule, ferner ist bei Gradiententrennungen das…

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